研究背景及目的β珠蛋白生成障碍性贫血（βthalassemia）是世界上最常见的常染色体单基因缺陷所致的遗传性疾病，也是对人类健康影响最大的慢性溶血性贫血病，其分子病理基础是由于β珠蛋白基因的突变或缺失，造成α珠蛋白肽链与非α珠蛋白肽链之间的不平衡，过剩的α肽链造成红细胞成熟缺陷和无效生成，最终使患者出现溶血性贫血。本病在世界范围内分布广，发病率高，危害大，长期以来珠蛋白一直是生物医学领域研究的热点之一，常被作为遗传病的重要范例。目前除通过社区筛查、遗传咨询和产前诊断等预防手段控制患者出生外，至今对重型和部分中间型β珠蛋白生成障碍性贫血患者的治疗仍有较大难度：规律输血并配合除铁剂，平均寿命仅达30岁左右；脾切除及脾动脉栓塞只对部分中间型β珠蛋白生成障碍性贫血患者有一定的疗效；造血干细胞移植能够根治，但相合配型的供体难寻、移植难度大而又费用高昂，限制了其广泛应用；目前最有前景的治疗方法是基因治疗（gene therapy），广义的基因治疗包括基因矫正治疗和基因调控治疗，基因矫正治疗是指运用DNA重组技术修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复功能而达到治疗遗传病的目的；理论上β珠蛋白生成障碍性贫血此类单基因遗传病是基因矫正治疗最理想的模型，人们一直期望其能成为第一个通过基因矫正而治愈的疾病，但因诸多技术难题至今尚未解决，目前仍停留于基础研究阶段。基因调控治疗是广义的基因治疗，是指运用药物来调控基因的表达而达到治疗疾病的目的。在临床上可见重型β珠蛋白生成障碍性贫血患者可以被表达增高的γ珠蛋白改善临床症状，受此启发进行的如何利用药物调控基因以阻止或延迟γ珠蛋白基因向β珠蛋白基因表达的切换及如何重新激活出生后已趋于关闭的γ珠蛋白基因表达的研究已被进行了20余年，由于此类治疗方法疗效确切，是目前唯一进入临床研究的基因治疗方法，给β珠蛋白生成障碍性贫血患者带来了希望。迄今所报道的已进行了比较深入研究的化学药如羟基脲（hydraxyurea）、5—氮胞核苷（5-azacytidine）、重组人类促红细胞生成素（recombinant human EPO）及丁酸盐类及其衍生物（butyric acid and derivatives）等存在不同程度的骨髓抑制、潜在的致癌性及费用高昂、用药不便等缺点；另一些处于基础实验研究的化学药离临床应用尚远，且远期对人体的毒副作用还无法明了，因此目前迫切需要发掘出一些新的更有效且安全实用的激活γ珠蛋白基因的药物。中药以其副作用小，资源丰富等优点引起人们的注意，因此许多国内外学者致力于在中药中筛选出更为有效、低毒和低成本的γ珠蛋白基因诱导剂。大多数γ珠蛋白基因诱导剂是从抗肿瘤药中发现的，化学药如5—氮胞核苷、羟基脲、阿糖胞苷、白消安、顺铂及阿霉素衍生物等，中药如三尖杉酯碱、甲异靛、长春新碱（三者是白血病化疗药）等。在本研究中我们选取11种在体外或体内研究中具有抗白血病功能的中药有效部位及活性成分作用于K562细胞，通过诱导K562细胞后联苯胺染色的血红蛋白定性实验，筛选出苦参碱具有诱导K562细胞向红系分化（erythroid differentiation）的作用，应用台盼蓝拒染活细胞计数和XTT法检测苦参碱对K562细胞增殖抑制（proliferative inhibition）的影响，通过联苯胺染色、western blotting及实时荧光定量RT-PCR分别从细胞水平、蛋白质水平和mRNA水平三个不同层次探讨苦参碱调控γ珠蛋白基因表达的作用，旨在从天然植物中筛选出新的γ珠蛋白基因诱导剂，为β珠蛋白生成障碍性贫血的治疗开辟新的途径。研究方法一、苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导向红系分化的研究方法1．苦参碱对K562细胞增殖抑制的影响：K562细胞培养于RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。①台盼蓝拒染活细胞计数：取指数生长期K562细胞，以5×10⁴ cells／mL密度接种于培养瓶中。分设苦参碱浓度为0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L的3个实验组，只加等量培养液的阴性对照组和丁酸钠浓度为0.5mmol／L的阳性对照组。从接种当时起每隔24 h取部分细胞进行台盼蓝拒染活细胞计数，连续计数6 d。②XTT法：取指数生长期K562细胞，制成1×10⁴ cells／mL的细胞悬液，设培养液组（只加培养液-本底背景）、苦参碱组（浓度分别为0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L）、阴性对照组（未加任何药处理）和阳性对照组（丁酸钠浓度为0.5mmol／L），于d 3检测苦参碱对K562细胞增殖抑制的剂量效应。2．苦参碱诱导K562细胞向红系分化的影响：①联苯胺染色检测苦参碱诱导K562细胞血红蛋白的表达：细胞培养及实验分组见台盼蓝拒染活细胞计数，从接种当时起每隔24 h先进行台盼蓝拒染活细胞计数，细胞活力在95％以上时，再取部分细胞进行联苯胺染色，计算联苯胺染色阳性细胞率（BZ％），连续计数6 d。②Wright-Gimesa染色检测苦参碱诱导K562细胞的形态学变化：将阴性对照组及0.10g／L苦参碱诱导d 4的K562细胞，分别离心制作细胞涂片，观察细胞形态学上的改变。二、苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的研究方法细胞培养及实验分组方法同台盼蓝拒染活细胞计数。1．Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞胎儿血红蛋白（HbF）的合成：做剂量效应时，收集0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L浓度苦参碱和0.5mmol／L丁酸钠诱导d 4及阴性对照组K562细胞；做时间效应时，分别在d 3、d 4、d 5收集0.10g／L苦参碱诱导后及阳性对照组、阴性对照组细胞。对上述收集的细胞提取总蛋白，先做蛋白定量，再以β-actin作为看家基因，应用Western blotting获得各组HbF及相对应的β-actin的蛋白印迹结果，通过凝胶分析软件进行蛋白条带的灰度测定，用各组HbF条带的灰度值除以各自相对应的内参β-actin的灰度值，进行蛋白上样量的校正，再以校正后的阴性对照组的表达量作为“1”，计算出各组相对于阴性对照组的倍数，对所得倍数进行统计学处理。2．实时荧光定量RT-PCR检测苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA的表达：采用相对定量解析方法进行mRNA表达量的分析。应用标准曲线进行样品间扩增效率校正；选择β-actin作为参比基因对所有样品进行归一化处理（RNA量校正）。制作标准曲线时以高浓度总RNA反转录后的cDNA作为样品，用EASY Dilution对样品进行10倍梯度稀释后，构建相对定量标准曲线。做剂量效应时，收集0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L浓度苦参碱和0.5mmol／L丁酸钠诱导d3及阴性对照组细胞；做时间效应时，分别在d2、d3、d4时收集0.10g／L苦参碱诱导后及阳性对照组、阴性对照组细胞。对所收集的细胞提取总RNA，对其进行质量鉴定后，行实时荧光定量RT-PCR反应，调整待测样品浓度，使所得Ct值落在标准曲线上，然后与标准样品同时分管进行扩增，得到的各个目的基因及看家基因mRNA的Ct值分别代入各自对应的标准曲线。以看家基因的定量结果作为“1”，计算出各组相对于看家基因的倍数，即为误差校正后的总RNA量。再以校正后的阴性对照组的表达量作为“1”，计算出各组相对于阴性对照组的倍数，对所得倍数进行统计学处理。结果一、苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导向红系分化的结果1．苦参碱对K562细胞增殖抑制的影响：通过台盼蓝拒染活细胞计数和XTT法检测，苦参碱诱导K562细胞后不同时间之间有显著差异（P=0.000）；不同浓度苦参碱诱导后的细胞数之间有显著差异（P=0.000）。各浓度苦参碱对K562细胞增殖均有抑制作用，增殖抑制程度随苦参碱浓度的增大抑制作用增加。苦参碱能够以剂量依赖的方式抑制K562细胞的增殖。2．苦参碱诱导K562细胞向红系分化的影响：①联苯胺染色检测苦参碱诱导K562细胞血红蛋白（Hb）合成：不同浓度苦参碱诱导不同时间联苯胺染色阳性细胞率（BZ％）有显著差异（P=0.000）。苦参碱能以剂量依赖和时间依赖的方式诱导K562细胞Hb合成，在0.10g／L浓度苦参碱诱导K562细胞d 4 BZ％达到高峰15.7％。②Wright-Gimesa染色检测苦参碱诱导K562细胞形态学变化：未诱导的K562细胞表现为未分化的祖细胞形态；诱导后的K562细胞在形态学上出现向红系分化的特征。二、苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的结果1．Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞胎儿血红蛋白（HbF）的合成：0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L浓度的苦参碱及丁酸钠诱导K562细胞d4 HbF合成增加倍数分别为1.08、1.53、1.36和1.52。0.10g／L、0.20g／L浓度的苦参碱与阴性对照间有显著差异（P＜0.01）；0.10g／L浓度苦参碱诱导K562细胞d3、d4、d5时及丁酸钠诱导d3时HbF合成增加倍数分别为1.38、1.81、1.54、1.92。苦参碱诱导K562细胞d3、d4、d5合成的HbF均与阴性对照组间有显著差异（P＜0.01）。苦参碱能以剂量依赖和时间依赖的方式诱导K562细胞合成HbF。在0.10g／L浓度苦参碱诱导K562细胞d4达到最佳剂量和时间效应。2．实时荧光定量RT-PCR检测苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA的表达：①^Aγ珠蛋白基因mRNA的表达：各浓度苦参碱诱导K562细胞d3及0.10g／L浓度苦参碱诱导K562细胞d2、d3和d4时，^Aγ珠蛋白基因mRNA的表达均与阴性对照组间无显著差异（P＞0.05）。②^Gγ珠蛋白基因mRNA的表达：0.05g／L、0.10g／L和0.20g／L浓度苦参碱及丁酸钠诱导K562细胞d3 ^Gγ珠蛋白基因mRNA表达增加倍数分别为：1.40、2.72、2.20和3.39。0.10g／L、0.20g／L苦参碱与阴性对照间有显著差异（P＜0.05）；苦参碱诱导d2、d3和d4及丁酸钠诱导d3时K562细胞^Gγ珠蛋白基因mRNA表达增加倍数分别为1.57、3.08、2.54和3.45。3个不同天数的苦参碱诱导后的^Gγ珠蛋白基因mRNA的表达均与阴性对照组间有显著差异（P＜0.01）。故苦参碱能以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞^Gγ珠蛋白基因mRNA表达。在0.10g／L浓度苦参碱诱导K562细胞d3达到最佳剂量和时间效应；苦参碱诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA表达增加，主要是通过诱导^Gγ珠蛋白基因mRNA表达增加实现的。结论1．联苯胺染色显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞血红蛋白的合成。2．Western blotting检测结果显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式诱导K562细胞血红蛋白F的合成，这表明苦参碱通过诱导K562细胞血红蛋白F的表达而促使血红蛋白的合成。3．实时荧光定量RT-PCR检测结果显示：苦参碱能够以剂量依赖及时间依赖的方式上调K562细胞^Gγ，珠蛋白mRNA表达，而对^Aγ珠蛋白mRNA表达无明显作用。这表明苦参碱是通过上调^Gγ珠蛋白mRNA的表达诱导K562细胞血红蛋白F的合成。4．苦参碱能够诱导K562细胞向红系分化，具有与丁酸钠相同的诱导γ珠蛋白基因的表达，是一种低毒、价廉的γ珠蛋白基因诱导剂。5．本研究为药物诱导调控治疗β珠蛋白生成障碍性贫血提供基础实验依据。主要创新点1．通过对K562细胞被诱导后联苯胺染色的血红蛋白定性实验，从11种在体外或体内研究中具有抗白血病功能的中药有效部位及单体中筛选出苦参碱具有诱导K562细胞向红系分化的作用。2．0.05g／L、0.10g／L及0.20g／L苦参碱对K562细胞增殖有抑制作用，随剂量加大细胞增殖抑制加著，苦参碱在抑制细胞增殖的同时伴有向红系分化的作用。首次证实苦参碱具有诱导胎儿血红蛋白合成增加的作用。3．首次证实苦参碱具有诱导K562细胞γ珠蛋白基因表达的作用，且主要是通过诱导^Gγ珠蛋白基因的表达实现的。4．苦参碱具有与丁酸钠相似的诱导γ，珠蛋白基因表达的作用，是一种低毒、价廉的γ珠蛋白基因诱导剂。