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目的:
(1)探讨体外分离、培养大鼠骨髓基质细胞(MSCs)的方法;
(2)建立Neuritin体外诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞的最佳实验条件;
(3)通过观察Neuritin诱导后骨髓源性神经元样细胞的形态以及标志物指标,评价Neuritin 诱导MSCs分化为神经元样细胞的作用。
方法:
(1)采用全骨髓贴壁筛选法分离、培养、纯化大鼠MSCs;
(2)利用免疫荧光技术检测大鼠MSCs表达表面标志物CD44/CD29/CD90/CD34/CD45的情况;
(3)分别于6小时、24小时、48小时、72小时,检测不同浓度Neuritin诱导的骨髓源性神经元样细胞的阳性率和细胞活力,确立Neuritin诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞的最佳实验条件;
(4)免疫荧光技术和Western blot技术检测骨髓源性神经元样细胞中神经细胞标志物(NSE)、神经细胞树突标记物(MAP-2)、星形胶质细胞标志物(GFAP)的定位和表达水平;
结果:
(1)应用全骨髓贴壁筛选法,在本实验室培养条件下,建立了简单、高效的MSCs的培养和分离方法;
(2)MSCs免疫荧光结果显示:在本实验室条件下培养的MSCs表达MSCs表面标志物CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞的表面标记物CD34、CD45。
(3)不同浓度Neuritin诱导MSCs6小时、24小时、48小时、72小时,神经元样细胞阳性率和细胞活力检测结果显示:0.25μg/ml组神经元样细胞阳性率均明显低于0.5μg/ml组,而0.5μg/ml组以上随着Neuritin浓度增高,神经元样细胞阳性率而呈下降趋势,0.5μg/ml在诱导后24小时神经元样细胞阳性最高;细胞活力随时间延长而呈下降趋势,24小时诱导组活细胞率均大于82%,其中0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/mlNeuritin组细胞活力大于对照组。故0.5μg/ml Neuritin诱导大鼠骨髓基质细胞24小时,其诱导效果最佳。
(4)0.5μg/ml Neuritin诱导MSCs24小时后的骨髓源性神经元样细胞免疫荧光和Western Blot结果显示:和对照组比较诱导组细胞定位于胞浆的神经细胞标志物(NSE)、神经细胞树突标记(MAP-2)均有表达,定位于胞浆的星形胶质细胞标志物GFAP没有表达;
结论:
(1)在本实验室建立了,体外分离、培养大鼠骨髓基质细胞(MSCs)的方法和条件,培养出了活性良好,纯度较高的大鼠骨髓基质细胞;
(2)Neuritin能诱导大鼠骨髓基质细胞出现类神经元样的形态变化,诱导后的骨髓源性神经原样细胞能表达神经细胞的特异性标记物。