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背景：骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）是目前发现的唯一具有明确诱导未分化细胞向成骨细胞方向转化并能异位成骨的细胞因子，在骨组织工程中应用广泛。BMP属于转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGFβ)超家族成员（BMP-1除外），目前在脊椎动物中已鉴定并克隆出20余种亚型。BMPs不仅是胚胎发育过程中重要的中胚层背-腹化发育促进因子，还可对成体细胞的增殖、分化、维持表型以及凋亡等诸多方面发挥调节功能。其倍受注目的生物学活性是诱导干细胞的成骨分化作用。其中BMP6主要定位于肥大软骨区，是细胞成骨分化尤其是软骨内化骨过程中的一个重要作用因子，目前对于BMP6的诱导成骨作用的分子作用机制还不甚明了。BMP6作为一类分泌型糖蛋白，首先要与细胞膜上的TGFβ受体结合方能细胞内发挥生物学功能。11种TGFβ受体均为激酶样跨膜蛋白，胞外和跨膜结构域可结合并固定配体，胞内激酶活性结构域则是活化下游转录因子的关键功能区，因此TGFβ受体在BMP信号转导途径中起着承上启下的桥梁作用，也是研究BMP6诱骨分化作用的起点和关键点。目的：鉴定分析与BMP6诱骨分化有关的TGFβ受体，为进一步从受体水平系统解析BMP6诱导成骨的分子机制提供实验依据。方法：1.将显性负性突变型TGFβ受体腺病毒和BMP6条件培养基分别作用于鼠间充质干细胞C3H10、鼠成肌细胞C2C12和鼠成骨细胞MC3T3，通过p12×SBE-Luc荧光素酶报告基因试验和早期成骨指标ALP定性、定量试验，初步筛选出与BMP6配体结合抑制成骨作用较强的dn-receptor；2.通过晚期成骨指标钙盐沉积试验、免疫细胞化学检测成骨特异蛋白骨钙素(OC)和骨桥素(OPN)表达、激光共聚焦显微镜观察Smad1/5/8核内转移情况、Real-time PCR检测BMP6靶基因Smad6和Smad7的表达水平、裸鼠皮下异位成骨，进一步分析初筛dn-receptor对BMP6的成骨抑制作用；3.构建相应受体的RNAi片段，鉴定并扩增；4.通过ALP定性、定量试验，RT-PCR检测ALP mRNA表达水平，观察RNAi细胞内源性TGFβ受体表达对BMP6诱骨作用的影响。结果：1.在C3H10、C2C12和MC3T3细胞中，dn-ALK2、dn-ALK3、dn-ALK6、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dn-ActR ⅡB可以明显抑制BMP6诱导的荧光素酶活性降低，ALP表达和活性下降，不同分化阶段的细胞类型之间未见明显差异。2.在C3H10细胞中，dn-ALK2、dn-ALK3、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ抑制ALP表达呈剂量依赖性趋势，dn-ALK2、dn-ALK3、dn-ALK6、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dn-ActR Ⅱ B可降低BMP6的成骨分化作用，晚期钙盐沉积减少，OPN和OC表达降低，Smad1/5/8磷酸化后核内转移减少，Smad6和Smad7mRNA表达水平下降，裸鼠皮下异位成骨骨块体积缩小，成骨成熟度减弱。3.成功构建BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡ B受体的RNAi质粒和阴性对照质粒，并各筛选出一条沉默作用最强的片段用于后续试验。4.检测细胞内源性TGFβ受体表达水平，发现三种细胞中ALK6和ActRⅡ B内源性表达均微少。将腺病毒si-ALK2、si-ALK3和质粒sh-BMPRⅡ、sh-ActRⅡ分别感染或转染C3H10细胞，si-ALK2、si-ALK3、sh-BMPRⅡ、sh-ActRⅡ可不同程度的抑制BMP6诱导的ALP活性和mRNA表达，ALK6和ActRⅡ B可能不是BMP6诱骨分化的生理性受体。结论：BMP6是诱导干细胞成骨分化的重要作用因子。在C3H10、C2C12和MC3T3细胞中，BMP6可与胞膜上的ALK2、ALK3、BMPRⅡ、ActRⅡ四种TGFβ受体结合，从而激活Smad因子发挥诱骨调控功能。ALK6和ActR ⅡB与BMP6有着强亲和力，但并非其成骨分化作用的生理性受体。