骨整合（osseointegration,OI）已被定义为严格规定的种植体与有序的活骨,在结构和功能上的直接结合,使种植体与不断改建的骨组织之间形成共生状态。这一概念自上个世纪50年代Branemark教授提出以来,随着研究和认识的不断深入,已被骨科学家、口腔学家及医用生物材料学家广为接受,并由此诞生了诸如生物材料、牙齿种植、骨整合假肢矫形等新型学科或新兴研究领域。近年来人们将钛种植体植入截肢患者残肢骨髓腔内形成骨整合,经皮肤与体外连接体连接提供支持功能,由此开创了经皮骨整合假肢（percutaneous osseointegrated prosthetic,POP）技术。与传统插座式活动假肢相比,这种固定的修复方式使肢体活动更易控制且运动方向更加灵活,并且由于植入体与骨的共生方式使佩戴者更容易产生肢体的反馈知觉,对种植体的感知性更强,这就为骨整合假肢修复的患者生活质量的提高带来了希望。然而,这种骨髓腔内植入的方式破坏了骨内膜组织结构以及骨髓腔的正常组织结构,并且截肢末端骨质由于受力屏蔽常常发生骨吸收,进而引起种植体周围软组织退缩和细菌感染,最终导致种植体松动脱落而治疗失败。因此,能否通过钛种植体的改型及植入方式的改进,把种植体直接从髓内的骨髓腔整合变为髓外的皮质骨整合,解决末端骨吸收的问题进而提高骨整合的效果,这也是该领域研究者及临床患者的期待。骨整合种植体与已改建的成熟骨组织整合,局部的组织学改变似应成为骨整合效果评价的金标准。本研究通过改变种植体的植入方式及外形设计,尝试骨髓腔外的骨整合,以保存骨髓腔内组织不受破坏,并减少应力屏蔽带来的残肢末端的骨吸收,达到持续性骨整合的目的。然而,近年来所能见到的骨整合体内实验的数据,诸如整合后不同阶段组织修复的组织学变化,包括细胞来源、分化命运及改建后细胞的归属等则所知甚少。人们已经清楚在这一过程中,骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）作为骨组织中重要的干细胞储备,是形成持续性骨整合和骨改建的关键。但骨整合组织的局部,种植体的物理信号如何被干细胞所感知,进而调控BMSCs成骨分化的分子机制仍然是该领域亟待回答的重要科学问题。我们推测在这一过程中,可能是整合素分子作为起始分子接受机械信号的刺激,协同BMPR促发了下游分子的级联反应调节了 BMSCs中成骨基因RUNX2的转录作用。本研究拟通过新型种植体的设计改型及移植方式的改进、新型种植体的有限元分析;动物体内种植体与骨组织整合局部影像数据和组织病理学观察;关键分子整合素α5β1及下游分子FAK,p-AKT和p-ERK的表达、BMPRI及下游分子p-SMAD1/5的检测三个研究内容:研究设计新型钛种植体及改变植入方式对骨整合的影响;有限元应力分析显示新型种植体的临床应用价值;揭示钛种植体诱导BMSCs成骨分化的机制,为新型骨整合种植体的临床应用提供指导,为新型生物移植材料的设计提供新的思路,为骨整合局部干细胞与钛生物材料相互作用的机制提供新的理论基础。研究方法:1.骨整合种植体的改型和力学分析:（1）骨整合种植体的改型:用UG NX 10.0软件设计植入髓腔内的内置柱状种植体及植入髓腔外皮质骨的新型外置帽状种植体,并按照兔胫骨的皮质骨内/外直径绘制出2种种植体及2种植入方式模式图;使用X光影像学方法测量兔胫骨的皮质骨内/外直径,按此平均值确定内置柱状种植体的外直径及外置帽状种植体的内直径;使用Auto CAD软件绘制种植体的机械加工图,采用4级纯钛,以机械加工和表面喷砂酸蚀处理的方法制作2种外形的种植体。（2）骨整合种植体的力学分析:采用ANSYS workbench17.0软件对种植体的应力分布进行三维有限元分布分析,用网格划分的有限元方法,分析2种种植体在模拟植入胫骨后受相同负荷下的负重功能、骨-种植体结合（bone to implant contact,BIC）界面的负重应力分布。2.种植体在兔胫骨内的移植方式改进、整合及评估:（1）种植体在兔胫骨内的移植方式改进:建立兔的胫骨截肢模型后,对照组用传统的髓腔内植入的方式在髓腔内制备螺纹,旋入内置柱状种植体;实验组用改进的移植方式,将胫骨的髓腔外皮质骨表面制备螺纹,并在植床皮质骨上制备散在3-4个直径1mm的穿透皮质骨的孔隙,增加受植区的血供,将外置帽状种植体在髓腔外皮质骨上移植并固定。移植完成后将肌肉、皮肤缝合,关闭创口,使种植体埋置皮下生长和愈合。（2）种植体移植后骨整合的观察:1)影像学:术后影像学X线观察种植体的植入部位;植入21天后对实验动物进行安乐死,对植床部位的骨组织取材进行Micro-CT扫描观察骨-种植体界面的骨整合情况。2)扫描电子显微镜（scanning electron microscopy,SEM）:同时取材后将2种种植体从胫骨植床部位拔出,使用SEM对骨整合后种植体表面的骨结合形貌进行观察。（3）种植体移植后骨整合的组织病理学评估:对植床部位骨组织取材进行硬组织切片和石蜡切片的HE染色、硬组织切片的甲苯胺蓝染色,观察BIC界面的骨整合情况及局部骨组织的形态学改变;用免疫组织化学方法检测植床部位新生骨样组织中成骨分化标志物骨保护素、骨钙素、BMSCs的标记物CD90、CD45、BMSCs的CXC趋化因子受体 4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）以及整合素 β1 的表达和分布情况。3.钛硬度促进hBMSCs成骨分化作用及机制:（1）钛硬度促进hBMSCs成骨分化作用:为了观察钛的硬度对细胞成骨分化的影响,提取hBMSCs培养并鉴定,同时制备2种硬度的基质,即～110GPa钛（Titanium,Ti）和1-10kPa软基质水凝胶,在2种硬度表面均铺以相同浓度的纤连蛋白,使用扫描电镜对表面孔隙和粗糙度进行观察。（2）钛硬度促进hBMSCs成骨分化的机制:将hBMSCs在软基质（1-10kPa）和硬基质钛（Ti）上培养,在第1和7天利用RT-qPCR技术检测成骨分化相关基因RUNX2、ALP、COL-I的表达,以及整合素α5、β1、机械敏感非特异性阳离子通道蛋白Piezo1、IA型BMP受体（BMPRIA）和IB型BMP受体（BMPRIB）的表达水平;同时在2种硬度上培养的hBMSCs中分别用BMPRI抑制剂（LDN-193189）处理后,Western Blot检测BMPRIA、p-SMAD 1/5蛋白表达以检测抑制效果;RT-qPCR检测成骨分化相关基因RUNX2、整合素β1和机械敏感阳离子通道蛋白Piezol的表达变化;Western Blot检测抑制BMPRI后整合素下游分子FAK,p-AKT和p-ERK的蛋白表达变化。研究结果:1.骨整合种植体的改型和力学分析:（1）骨整合种植体的改型:胫骨植床部位平均直径为8mm;按照直径制作2种外形的骨整合种植体及2种植入方式;使用4级纯钛,通过机械加工及表面喷砂酸蚀的方法,制备出新型的外置帽状种植体和作为对照的内置柱状种植体,结果提示两者之间与骨发生整合的部位不同,前者位于骨髓腔外部直接与皮质骨整合,保存更多的骨髓腔内骨髓组织,后者位于骨髓腔内部植入。（2）骨整合种植体的力学分析:三维有限元应力分布分析显示,当模拟2种种植体植入骨组织并给予同样的负载条件时,在内置柱状种植体上最大应力集中在连接杆处,最大应力传导至远离残肢末端的上段骨侧壁,残肢末端的皮质骨的生物应力分布较小;而外置帽状种植体最大应力集中在种植体底座和残肢末端的皮质骨,此处为种植体的最大直径而不易发生形变,根据骨细胞力学理论,此结果提示,外置帽状种植体受负重力能够避免残肢末端的骨质吸收。2.种植体在兔胫骨内的移植方式改进、整合及评估:（1）种植体在兔胫骨内的移植方式改进:兔胫骨截肢手术建立成功;通过不同方式将2种种植体分别植入髓腔内和髓腔外皮质骨,并形成初期的稳固性,术后创口愈合良好无感染,种植体无松动,体内移植实验成功。（2）种植体移植后骨整合的观察:1)术后X线影像观察种植体的植入位置正确符合实验要求;移植成功21天后Micro-CT扫描结果显示,内置柱状种植体及外置帽状种植体的BIC界面均有新骨生成和骨整合;但植入外置帽状种植体的植床皮质骨孔隙内及髓腔内大量骨新生,在外置帽状种植体没有接触的胫骨区域,没有观察到骨髓腔内的骨新生,而是骨外膜的骨膜化骨。表明外置帽状种植体引起BIC处的骨整合,并引起皮质骨的孔隙内及骨髓腔内的远端成骨,且没有发生末端骨吸收。2)种植体与骨整合的界面SEM扫描显示,外置帽状种植体与内置柱状种植体表面均有骨细胞铺展,伸展的突起锚固在钛的表面,并与相邻骨细胞的突起相连,拔出的种植体表面带有新生的类骨组织附着,提示外置帽状种植体与内置柱状种植体一样发生了表面与骨组织的整合,且整合效果无显著差别。（3）种植体移植后骨整合的组织病理学评估:组织学上,硬组织切片和脱钙石蜡切片的HE染色以及硬组织切片甲苯胺蓝染色均表明,2种种植体的BIC界面均有骨样组织新生和整合;内置柱状种植体周围的末端皮质骨有破骨细胞和骨吸收陷窝;新型外置帽状种植体的残肢末端未出现皮质骨吸收,且骨细胞密度明显增高,末端骨髓腔内有大量蜂窝状的类骨组织生成,成骨细胞在新生的骨基质周围整齐排列。免疫组化染色显示,外置帽状种植体对应的残肢末端骨髓腔内有大量新生类骨组织,该区域骨保护素及骨钙素呈棕色颗粒状阳性表达;BMSCs标志物CD45为阴性表达,CD90为阳性表达,BMSCs的特异性趋化因子受体CXCR4呈阳性表达;同时整合素β1在此区域呈棕色颗粒状阳性表达。提示,在体内外置帽状种植体诱导了远端成骨,这一过程中BMSCs可能是成骨分化的主要细胞来源,钛种植体能够诱导BMSCs趋化到临近部位完成向成骨分化,在此过程中整合素β1可能参与发挥重要作用。3.钛硬度促进hBMSCs成骨分化作用及机制:（1）钛硬度促进hBMSCs成骨分化作用:将hBMSCs在软基质（1-10kPa）和硬基质钛（Ti）上培养,RT-qPCR检测显示,与软基质上相比,第1和7天硬基质上的hBMSCs中RUNX2、COL-I及ALP的mRNA水平均显著高表达,RUNX2表达量随时间显著上升。提示,hBMSCs成骨分化转录基因的作用逐渐增强;而COL-1及ALP作为早期成骨分化的标志物其表达随时间明显下降。因此,钛的硬度能够促进hBMSCs成骨分化。（2）钛硬度促进hBMSCs成骨分化的机制:RT-qPCR检测结果显示,第1天硬基质上hBMSCs的整合素α5β1、BMPRIA和BMPRIB均明显高表达,但第7天硬基质上整合素α5β1和BMPRI均明显下降,但此时Piezol表达明显升高。在2组中加入BMPRI的抑制剂（LDN-193189）处理7天后,WB检测结果显示,2组中BMPRIA、p-SMAD1/5的蛋白表达均显著下降;RT-qPCR结果显示,抑制BMPRI后2组中RUNX2的mRNA表达显著下降,同时整合素β1的mRNA表达显著下降,并且整合素下游相关分子FAK,p-AKT和p-ERK的蛋白表达显著下调;而抑制BMPRI后Piezo1的mRNA表达显著升高。以上结果提示,钛的硬度促进hBMSCs成骨分化的初期过程中,整合素α5β1-FAK通路可能发挥重要的起始功能,而BMPRIA和BMPRIB可能与整合素α5β1-FAK发挥协同作用,Piezol则在成骨分化后期发挥作用。因此,钛的硬度因素能够显著促进hBMSCs的成骨分化,可能与早期整合素α5β1和BMPRI发挥协同作用有关。结论:1.首次设计并制作了适用于兔骨整合的新型外置帽状种植体,此种植体最大应力集中在底座和残肢末端的骨质,此处为种植体的最大直径,不仅不易发生形变,而且给出了该种植体移植后残肢末端骨质吸收减轻的力学原理。2.新型外置帽状种植体移植后可引起有效的骨整合,其局部病理组织学改变,包括间充质干细胞的成骨分化、骨基质分泌及骨化等与种植体髓腔内移植基本相同,但移植部位骨吸收明显减轻,且可见髓腔内大量骨样组织新生,对临床应用具有重要的指导价值。3.体内和体外均表明钛基质能够诱导BMSCs成骨分化,此过程中整合素β1发挥重要作用。钛的硬度是其促进BMSCs成骨分化的重要因素,整合素β1、BMPRI在此过程中起协同促进的作用。