研究背景:在皮肤的众多威胁中,烧伤是最致命的健康问题,因为其伴随而来的细菌感染可能同时损害人皮肤的表皮和真皮层,导致伤口加深甚至死亡。因此,对于烧伤病人来说,避免感染对于促进创面愈合至关重要。同时,伤口敷料具有抗粘附作用也是非常重要的,因为更换敷料时如果敷料粘附于伤口可能会引起病人疼痛,对新生上皮也是一种损害。对于烧伤创面,伤口敷料既可以保持伤口清洁,又能抵抗外部污染而被广泛应用于临床。传统的伤口敷料(纱布、绷带)也可以对外部环境提供类似的屏障,但实际上,降低细菌感染的效果不令人满意。另外,由于伤口分泌液可以渗透到传统敷料纤维中,使传统敷料易于粘附于伤口,从而引起病人不舒服,甚至对新生上皮组织带来二次损伤。目前临床上可供选择的伤口敷料来源于两种,天然的和合成的材料,比如说:壳聚糖、藻酸盐、硅胶、聚丙烯酰胺和聚乳酸等,近来引起了人们的特别关注。这些材料不仅柔韧性好、安全、生物相容性好和无毒性,同时也能吸收大量的创面分泌物,来保持理想的湿度和提供一个令人满意的创面愈合环境。但是这些敷料在抵抗细菌感染、抑制细菌粘附和杀灭细菌的能力上仍然面临巨大挑战。整合抗菌剂到创面敷料中使之获得抗感染能力,典型的局部抑菌剂有碘酒、三氯苯氧氯酚、季铵盐、纳米银,和氯胺等。聚二甲基硅氧烷(PDMS),一种具有疏水性、无毒、生物相容性好和橡皮样弹性的聚合物已经在医用敷料的制备上占据有力竞争地位。目前急需避免用抗生素来预防感染,因为抗生素加剧了多重耐药感染生物体的出现,一个重要的指标是医用敷料使用后随之而来的菌群生长和细菌粘附。近年来,提出PDMS通过灌注大量的润滑液,从而获得一个光滑面,使之具有抗粘附作用。因此我们以硅油灌注的聚二甲基硅氧烷(iPDMS)为基础,描绘了一个医用敷料概念:抗粘附的、润滑液灌注的光滑聚合物。3D打印技术依据计算机操作模型可以直接打印各种各样的、不同需求的样式。最近,生物墨水的创新和力学的高分辨力使3D打印机在生物医学机构上拥有更多的应用比如说生物传感器和组织工程支架。3D打印技术的到来也描绘了一个自定义创面敷料时代,敷料空隙大小、尺寸、厚度的控制和负载活跃微粒时间的控制。目的:本研究,我们依据相关文献,从体外到体内去证实iPDMS/AgNPs是否具有抗粘附特性和抑菌活性。我们通过扫描电镜和能谱来探索材料的形态学。在抗粘附和抑菌活性实验中,我们选择了临床上常用的标准耐药菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。我们用细菌共培养实验和血迹实验来探索材料的抗粘附能力。另外,我们应用了小鼠全层皮肤创面感染模型来评估材料在体内的抗菌活性和生物特性。材料和方法:我们购买得到PDMS、固化剂、纳米银和5Cst硅油。所有使用的原材料获得除非另作说明都没有进一步提纯。墨水配方可打印的墨水是预聚物和固化剂按照质量比1:1混合得到,彻底搅拌之后,添加质量比为0.5%和2.5%的纳米银,然后将混合物在冰浴下超声处理1个小时。最后将混合物放在60℃热水浴中30分钟,直到形成最后的墨水。3D打印所有创面敷料都是由3D打印机构建的。仔细将墨水注入推出注射器(通过一个20G平头电极针固定在传送机上的)。打印期间,不同需求的3D形状依据计算机辅助设计装在一个载玻片上。打印后,样品放在热水浴中保持2小时,直到完全固化。iPDMS的准备完全固化后,3D打印的PDMS膜片首先用酒精漂洗并干燥。然后将它们转移到一个充满5cST硅油的玻璃容器中,浸泡18个小时。扫描电子显微镜iPDMS/AgNPs样品纳米复合材料的形态特征是通过扫描电子显微镜(Hitachi,S-3400N,Japan)观察。样品首先用去离子水小心清洗、干燥和金包被,然后在真空条件下通过扫描电子显微镜观察。动物实验动物购买于陆军军医大学动物研究所,动物规格选择体重在25g左右的Balb/c雄性小鼠。动物饲养方面,我们将实验小鼠单独笼饲养,按照动物饲养标准严格饲养,本实验过程中所有有关实验动物的相关实验都严格遵照陆军军医大学实验动物伦理委员会的相关规定。细胞毒性试验成纤维细胞原代培养:先取新生绿色荧光蛋白转基因小鼠,然后将小鼠用75%酒精消毒后,在超净工作台上,按照规定剥取新生小鼠皮肤。用小剪刀裁剪成0.6 cm×0.6cm皮片大小,浸泡于0.5%DispaseⅡ溶液中,第二天出,轻柔分离皮片的表皮和真皮,小心收集小鼠真皮组织,在PBS溶液中漂洗3次。剪碎后,加入0.25%胰酶溶液,最后置于恒温摇床37℃内,摇晃消化约10分钟。加入DMEM终止消化,1000转离心机中离心10分钟。接种至25cm培养瓶内,置于5%CO2细胞孵育箱内培养。后科按要求传代。CCK-8试验:1、实验器材:先准备96孔板和1%胎牛血清的DMEM培养基。2、接种:取浓度为1×10~4/ml的成纤维细胞悬液接种100μL到96孔板中。3、计数:从第1天接种后到第6天,每天检测材料上的成纤维细胞数量。抗粘附试验使用临床上常见的标准耐药菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,先扩增细菌(摇菌过夜)至1*10~9CFU/ml,然后稀释菌液为1*10~4CFU/ml。材料预处理(N=3):75%酒精室温浸泡20min灭菌,PBS洗3遍。细菌粘附及培养:向含膜片的孔内加入200ul稀释菌液,37℃孵育1.5h;PBS漂洗1遍;将膜材料贴于平皿的底部,展平,倒入预热冷却至45℃的LB琼脂,凝固后,37℃培养过夜。最后取出平皿,拍照、计数。体外抗菌活性实验1、细菌准备:标准金黄色葡萄球菌\大肠杆菌,先扩增细菌,200ul冻存菌液加入10mlLB培养基中,200rpm,37℃过夜至对数生长期,然后稀释菌液为OD值=0.07。2、材料预处理(N=3):材料剪切成1cm*1cm大小,75%酒精室温浸泡20min灭菌,PBS洗3遍,每遍5min。3、共培养及检测:向含一片材料的24孔板孔内加入500ul稀释菌液,37℃,50rpm孵育24h,测定菌液OD值。iPDMS/AgNPs在动物感染模型中的作用为了检验iPDMS/AgNPs在创面愈合、创面细菌计数、再生上皮和肉芽组织形成上的潜在作用,我们使用了小鼠全层皮肤动物感染模型。1、材料准备:材料分为8组,分别是阴性对照组(无菌只贴负压膜)(A),阳性对照组(即滴菌又贴负压膜)(B),PDMS(C),PDMS+oil(D),PDMS+0.5%AgNPs(E),PDMS+2.5%AgNPs(F),PDMS+0.5%AgNPs+oil(G),PDMS+2.5%AgNPs+oil(H)。用打孔器制成6mm直径圆片,根据需要可以行酒精消毒处理、PBS漂洗后烤干。2、细菌准备:制备菌液浓度为10~8CFU/ML的标准金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细菌混合液。3、动物准备:12只8-10周BALB/c雄性小鼠,剃发器剃毛、脱毛膏清除干净毛发,对称打孔6mm。4、实验过程:分别于创面上滴加15-20ul的细菌悬液,稍微晾干。分别于D1\D3\D5\D7揭开创面拍照,取渗出液1ul稀释10~4倍涂板培养过夜,换材料,贴膜。各个时间点细菌菌落计数及拍照。分析创面大小,统计分析。创面愈合评价创面在伤后第1、3、5和7天拍照,并用IPP 6.0软件测量。用一下公式得到创面愈合率:创面愈合率=(O-R)/O×100%.O代表原始创面面积,R代表残余创面面积。创面细菌计数在伤后第3天和第7天,取创面分泌物1 ul,稀释10~4倍,涂板,培养过夜,最后拍照计数。苏木紫伊红(HE)染色在伤后第3天和第7天,处死小鼠,提取创面组织,并保存在4%多聚甲醛之中。嵌入石蜡,切片,用苏木紫伊红染色。用软件Image J测量新生上皮长度和肉芽组织厚度。统计分析所有的结果都是平均数±标准差(n=5),并且用单因素方差分析。结果:1我们通过一台全能3D打印机获得可调的iPDMS/AgNPs创面敷料,它可以轻易地折叠和拉伸,从而说明iPDMS/AgNPs膜片具有良好的弹性。另外硅油修饰的PDMS膜片表面光滑无凸起,但是纳米银点缀的iPDMS膜片表面有较为均匀的凸起存在,且平均直径为14.8nm,这个值与纳米银的大小(<100nm)的报道一致。同时,iPDMS/AgNPs的能量分散分析显示含有1.1%银元素,参考文献和其他的研究结果,证实了纳米银的存在,说明我们已经成功制备了iPDMS/AgNPs纳米银复合材料。2细胞毒性试验显示,不同纳米银浓度的iPDMS/AgNPs对细胞增殖从第1天到第7天呈现极少的抑制作用。最近的研究认为纳米银的细胞毒性是剂量依赖的,并且低剂量可能无毒,我们通过CCK-8实验仔细检测iPDMS/AgNPs的细胞毒性。我们证实iPDMS/AgNPs对成纤维细胞没有明显的毒性反应,我们的研究结果与之前的研究一致,认为纳米银的细胞毒性在合适的浓度是无毒的,仅仅发现在高浓度时有一定毒性。3抗菌的一个重要指标是细菌粘附和随之而来的菌群形成。我们使用临床上常见的两种标准耐药菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)来检测iPDMS/AgNPs抗粘附能力。很明显,硅油修饰的膜片细菌菌落数明显少于其他组,因此,我们证实硅油修饰的膜片具有更好的抗粘附能力,这个特点可能有效提高创面愈合。4材料与细菌共培养显示,纳米银修饰的膜片组OD值比其他组要低,证实了iPDMS/AgNP对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较好的抗菌活性。我们的研究结果显示iPDMS/AgNPs在体外能够有效地抗感染,最终可能促进创面愈合,这与之前的研究结果一致,纳米银复合材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的良好的抗菌活性,可能归因于纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞壁结构的破坏作用。5为了进一步探索iPDMS/AgNPs的作用机制,我们使用小鼠全层皮肤感染创面模型,来研究它对创面愈合率、新生上皮长度和芽组织厚度的影响。在伤后第3天和第7天,含有纳米银和硅油组的创面愈合率高于空白组和PDMS组,证实了iPDMS/AgNPs能有效提高创面愈合率,这与之前的研究一致。组织学分析显示,在使用iPDMS/AgNPs后,再生上皮长度和肉芽组织厚度明显变长变厚。总之iPDMS/AgNPs能够促进上皮再生和肉芽组织形成,从而加速创面愈合,与相关的文献一致。结论:在此,我们提出了一种新颖的创面敷料iPDMS/AgNPs,它是用3D打印机设计的,能够满足不同病人的各种需求。这种环境友好的新颖的创面敷料不仅具有良好的生物相容性、柔韧性、抗粘附能力和抗菌活性,也能有效促进创面愈合。总而言之,iPDMS/AgNPs在不久将来可能是一种理想的创面敷料。