论文部分内容阅读
目的:原发性肝癌(以下简称肝癌)为常见的恶性肿瘤之一,发病隐匿,进展速度快,预后差。目前对于肝癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗,包括:手术切除、射频消融、微波固化、化疗栓塞(TACE)、放射治疗、生物免疫治疗等,手术切除为目前最主要、最有效的方法,但患者术后5年生存率低,主要是因为患者术后肿瘤的复发及转移。肿瘤的生长及转移依赖于新生血管的形成,血管的新生是一个多因素调节的过程,血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管形成的重要调节因子之一,VEGF除具有促进血管形成作用外,还具有促进淋巴管形成、调节脂质代谢、保护及营养神经等作用,并且与肿瘤的发生、进展密切相关。现已发现VEGF家族共有7个成员,VEGF-B为其中重要的一员,我们前期的研究发现肝癌的发生、发展与VEGF-B密切相关。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)为转录后的基因沉默,可以实现对目的基因的高特异、高效沉默,小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰中主要介导因子。本实验从人类VEGF-B基因中选取3个靶点,利用RNA干扰技术体外构建3个VEGF-B基因靶向siRNA,转染人肝癌细胞HepG2细胞并建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察抑制VEGF-B基因后对肝癌细胞裸鼠皮下种植瘤的影响,从而为肝癌的基因治疗提供新的靶点及理论依据。方法:从人VEGF-B基因中选取3个靶点,利用RNA干扰技术体外构建3个靶向siRNA。常规培养人肝癌细胞HepG2细胞,借助质粒载体将阴性空白对照质粒及3个阳性VEGF-B基因靶向siRNA质粒转染入HepG2细胞(转染后分别命名为:Bt0,Bt1,Bt2,Bt3),转染48小时后观察转染效率,用blasticidin稳定筛选并培养扩增。将24只裸鼠随机分成4组,并将转染筛选后的4组细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠皮下种植瘤模型(分别命名为:mBt0组,mBt1组,mBt2组,mBt3组)。常规饲养裸鼠并观察裸鼠皮下种植瘤的生长情况,30天后处死裸鼠,并测量计算皮下种植瘤的体积和重量,利用Western blot方法检测种植瘤VEGF-B蛋白表达情况。结果:1以质粒为载体,可成功将体外构建的VEGF-B基因靶向siRNA转染入肝癌细胞HepG2细胞,转染48小时后,转染效率可达70~75%。2对照组mBt0组与实验组mBt1组、mBt2组、mBt3组裸鼠皮下均成瘤,3个实验组裸鼠皮下种植瘤生长速度较对照组缓慢,30天后种植瘤体积分别为:(1.671±0.131)cm3、(1.083±0.224)cm3、(1.252±0.204)cm3、(1.127±0.276)cm3,瘤体重量分别为:(1.049±0.104)g、(0.681±0.130)g、(0.804±0.119)g、(0.733±0.138)g。3个实验组瘤体的体积及重量均显著小于阴性对照组(P<0.05),仔细解剖裸鼠,未见远处转移。3Western blot方法显示:3个实验组(mBt1、mBt2、mBt3)条带亮度明显暗于对照组(mBt0)条带,目的条带/β-actin条带灰度值示:0.692±0.059、0.411±0.039、0.544±0.063、0.503±0.102,3个实验组种植瘤VEGF-B蛋白表达水平显著低于阴性对照(P<0.05)。结论:体外构建VEGF-B基因靶向siRNA成功转染HepG2细胞并构建裸鼠皮下种植瘤模型后,可明显抑制裸鼠皮下种植瘤的生长及种植瘤VEGF-B蛋白的表达。