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胰腺为人体内仅次于肝脏的第二大腺体,是内外分泌混合腺。外分泌部占腺体的绝大部分,属于消化腺。内分泌部是散在分布于外分泌部之间的胰岛。胰岛主要有α、β、PP、δ和ε细胞,其中β细胞分泌的胰岛素和α细胞分泌的胰高血糖素协同作用能保持血糖水平处于动态平衡。若β细胞功能障碍,胰岛素分泌不足,可导致血糖升高,并从尿中排出,即发生糖尿病。研究者通过细胞世系追踪实验证明,在胰腺胚胎发育过程中所有的外分泌和内分泌细胞起源于一群未分化的胰腺祖细胞。并且研究报道,在小鼠初生和成体胰腺中也分布着少量多分化潜能的胰腺祖细胞,它们参与维持胰腺的生长以及损伤后功能恢复。microRNAs（miRNAs）是一种高度保守的、非编码的微小RNA,通过结合到与其种子序列互补配对的靶基因上降解靶mRNA或抑制其它的翻译,在转录后水平调控基因表达。近年的研究发现,miRNAs参与调节胰腺的发育过程以及胰腺的功能维持。在小鼠胰腺中将控制miRNAs加工成熟的Dicer酶特异性敲除后,影响内分泌和外分泌细胞、导管细胞的发育,尤其β细胞大量减少;进一步研究发现,miR-375和miR-124在胰腺β细胞在高表达。将小鼠和斑马鱼的miR-375特异性抑制后,胰岛形态发生异常并且内分泌细胞比例失调。此外,如果miR-375和miR-124在胰腺β细胞表达异常,将影响insulin的合成和分泌。以上研究表明,miR-375和miR-124参与调节胰腺发育以及胰腺的功能维持,但是miR-375和miR-124调控胰腺祖细胞增殖分化的作用还没有相关报道。本课题首先分析小鼠胚胎胰腺发育过程以及胰腺细胞系中miR-375和miR-124的表达模式。然后在分离的小鼠成体胰腺祖细胞中过表达或抑制miR-375和miR-124,检测对胰腺祖细胞增殖能力的影响,并且进一步检测对胰腺祖细胞向内分泌细胞分化的影响。接着通过生物信息软件结合生物学实验对miR-375和miR-124的相关功能靶基因进行预测、筛选和验证,阐明miR-375和miR-124调控胰腺祖细胞增殖分化的分子原理。本课题的研究成果将加深我们对胰腺祖细胞增殖分化分子机制的了解,进一步揭示胰腺发育的分子机理,为糖尿病等胰腺疾病的治疗提供理论基础。1.研究材料和方法1.1检测小鼠胚胎期胰腺和胰腺细胞系miR-375和miR-124的表达谱。提取胚胎期E12.5和E15.5天的小鼠胰腺以及小鼠胰腺祖细胞、内分泌β细胞的总RNA,经消化残余的基因组DNA后,为RNA加上βolyA尾,反转为cDNA,通过RT-PCR或实时定量PCR检测miR-375和miR-124的表达情况。1.2检测过表达miR-375和miR-124是否影响胰腺祖细胞的增殖。在胰腺祖细胞过表达miR-375和miR-124,倒置显微镜下观察,结合血球计数板查数、CCK8方法以及Ki67免疫染色方法检测miR-375和miR-124是否影响胰腺祖细胞的增殖能力。1.3检测抑制内源性miR-124是否影响胰腺祖细胞的增殖。将与miR-124互补配对的2’-甲氧修饰的反义寡核苷酸转染至胰腺祖细胞,抑制细胞内源性miR-124的作用。在转染后72h,CCK8方法检测细胞的增殖变化。1.4 miR-375和miR-124下游靶基因的预测、验证和功能研究。确定miR-375和miR-124对胰腺祖细胞增殖的影响后,通过miRNA靶基因预测软件Targetscan分析并筛选与细胞增殖相关的靶基因,将预测的靶基因的野生型或突变的3’UTR克隆至萤火虫荧光素报告载体中,利用双荧光素酶报告系统检测是否为靶基因。若为靶基因,将miR-375和miR-124转染至胰腺祖细胞中,实时定量PCR和western blot方法检测靶基因的mRNA和蛋白的表达变化。在胰腺祖细胞中,利用siRNA干涉靶基因,CCK8方法以及Ki67免疫染色检测细胞增殖是否受影响,确定miR-375和miR-124是否通过下调该靶基因的表达而抑制细胞的增殖。1.5 miR-124对胰腺祖细胞PI3K/AKT以及MEK/ERK信号通路的影响。PI3K特异性抑制剂LY294002和MEK1/2的特异性抑制剂U0126分别处理胰腺祖细胞,western blot检测AKT和ERK1/2蛋白磷酸化水平,同时CCK8方法检测细胞的增殖变化,确定胰腺祖细胞增殖是否受到这两条信号通路的调控。在胰腺祖细胞中过表达miR-124,western blot检测AKT和ERK1/2蛋白磷酸化水平,明确miR-124是否通过作用PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路调节胰腺祖细胞的增殖。1.6检测过表达miR-375和miR-124是否促胰腺祖细胞向β细胞方向分化。在胰腺祖细胞过表达miR-375或miR-124,RT-PCR检测胰腺祖细胞相关标记性分子以及β细胞相关标记性分子的表达变化,检测miR-375和miR-124是否能促进胰腺祖细胞向β细胞方向分化。1.7检测过表达miR-124是否促进胰腺祖细胞向神经细胞方向分化。在胰腺祖细胞中过表达miR-124,经消化残余的基因组DNA后,反转为cDNA。RT-PCR检测神经细胞相关标记性分子的表达,检测miR-124是否促进胰腺祖细胞向神经细胞方向分化。2.主要研究结果2.1 miR-124和miR-375在E12.5的胰腺表达低,在E15.5的胰腺表达升高;miR-375 在 MIN6 细胞中处于高表达,而在胰腺祖细胞中没有检测到;miR-124 在 MIN6 细胞中高表达,而在胰腺祖细胞中相对低表达。2.2在胰腺祖细胞中过表达miR-124和miR-375后,血球计数板查数法、CCK8方法和Ki67免疫染色方法都检测发现细胞的增殖能力降低;但抑制胰腺祖细胞内源性miR-124后不影响细胞的增殖能力。2.3结合双荧光素酶报告系统、western blot方法鉴定IQGAP1、SOS 1、STAT3和CCND2是miR-124的靶基因。RT-PCR检测发现,miR-124通过降解IQGAP1的mRNA从而在转录后水平抑制基因的表达。然而,miR-124不降解SOS1、STAT3和CCND2等基因的mRNA,只抑制它们翻译成蛋白。在胰腺祖细胞中利用siRNA分别干涉IQGAP1、STAT3和CCND2表达都抑制细胞的增殖;但是干涉SOS1的表达不影响细胞的增殖能力。2.4结合双荧光素酶报告系统、western blot方法鉴定YAP1是miR-375的靶基因。RT-PCR检测发现,miR-375也是通过降解YAP1的mRNA从而在转录后水平抑制基因的表达。在胰腺祖细胞中利用siRNA干涉YAP1的表达抑制细胞增殖。2.5在胰腺祖细胞过表达miR-124,AKT的308位苏氨酸和473位丝氨酸磷酸化水平显著降低,ERK1/2的磷酸化水平也显著降低。胰腺祖细胞经PI3K特异性抑制剂LY294002处理后,western blot检测发现,AKT的308位苏氨酸和473位丝氨酸磷酸化水平显著降低,并且抑制细胞的增殖能力;MEK1/2的特异性抑制剂U0126处理后,ERK1/2的磷酸化水平显著降低,然而不影响胰腺祖细胞的增殖能力。2.6在胰腺祖细胞中过表达miR-124和miR-375后,RT-PCR检测发现,胰腺祖细胞特异性标记性基因,如Nestin、Hesl和c-Met等基因的表达与对照组相比没有显著变化;此外,过表达miR-124和miR-375检测不到β细胞标记性分子的表达。2.7在胰腺祖细胞中过表达miR-124后,倒置显微镜下观察发现,细胞出现类似神经突出样结构;RT-PCR检测发现星形胶质细胞标记性基因GFAP出现表达,高表达于神经元的基因tubb3的表达升高,而成熟神经元标记性基因如MAP2没有表达。3.结论3.1 miR-124在胰腺祖细胞中表达水平低,过表达miR-124通过靶向抑制IQGAP1、STAT3、CCND2的表达从而抑制胰腺祖细胞的增殖;此外,miR-124也通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制胰腺祖细胞的增殖。然而,抑制胰腺祖细胞内源性miR-124的表达,则对细胞的增殖能力没有影响,这可能与在胰腺祖细胞中miR-124的表达水平低有关。3.2在胰腺祖细胞中检测不到miR-375的表达,但在β细胞系中高表达。在胰腺祖细胞中异位表达miR-375,通过靶向抑制YAP1的表达从而抑制细胞的增殖。3.3过表达miR-124或miR-375不促进胰腺祖细胞向β细胞方向分化。