【摘 要】
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新孢子虫(Neospora caninum)是一种专性细胞内寄生的原虫,主要引起牛、狗等动物的神经肌肉性疾病和流产,尤其是奶牛的流产,严重影响养牛业的发展。新孢子虫病的早期诊断是有
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新孢子虫(Neospora caninum)是一种专性细胞内寄生的原虫,主要引起牛、狗等动物的神经肌肉性疾病和流产,尤其是奶牛的流产,严重影响养牛业的发展。新孢子虫病的早期诊断是有效控制该病发生和蔓延的重要手段。研究表明,新孢子虫表面蛋白NcSRS2具有较好的免疫原性,是新孢子虫病诊断和疫苗研究的重要候选抗原。本试验拟采用新孢子虫表面蛋白NcSRS2建立间接ELISA诊断方法,用于牛新孢子虫病诊断。参考GenBank登录的新孢子虫NcSRS2全基因序列,在163～1141处设计一对引物,通过PCR扩增出NcSRS2的相应片段,构建T-A克隆,经PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析后,再亚克隆到表达载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-32a-NcSRS2t,转化DH5α感受态细胞,经PCR扩增和酶切鉴定后,保存重组质粒。将重组质粒pET-32a-SRS2t转化表达菌BL21,用IPTG诱导表达融合蛋白NcSRS2t。Western blotting检测,表达的融合蛋白NcSRS2t能够被新孢子虫阳性血清所识别。将表达的融合蛋白NcSRS2t收集、纯化后作为抗原,包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立检测牛新孢子虫抗体的间接ELISA。试验结果表明,重组蛋白的最佳包被浓度为5μg/ml,最佳封闭时间为2h,检测血清稀释度为1︰200,抗原和抗体作用时间为1h,HRP标记的兔抗牛IgG的工作浓度为1︰5000,最佳显色时间为10 min,用2mol/L H2SO4为终止液,确定阴阳性的临界OD值为0.275。
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