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慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是全球面临的重要公共卫生问题之一,近年来CKD的患病率也在逐渐增高。2012年我国肾脏病学专家流行病学调查显示我国CKD患病率已达10.8%[1]。目前,越来越多的研究结果证明肾小球足细胞在慢性肾小球肾炎及CKD的发生发展中起了重要作用。金丝桃苷(hyperoside,HYP)是传统中药黄蜀葵花(Abelmoschus manihot(L.)Medik.)中提取出的活性物质,普遍存在于金丝桃科、葵科等的果实和全草中。近年来,大量研究证实金丝桃苷具有广泛的药理学作用,如:降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌及抗凝血作用。黄葵是一种治疗CKD的传统中药,其主要成分即为黄蜀葵花提取物之一的HYP[2]。HYP可通过清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)及提高抗氧化酶的活性减轻心肌细胞缺血再灌注损伤[3-6]。体内实验发现HYP可以保护线粒体功能,减轻大鼠阿尔莫兹海默病症状[7]。线粒体是一个双层膜结构的细胞器,其形态、分布及活性由分裂和融合所调控[8-11]。在哺乳动物细胞内,线粒体融合和分裂的平衡对于维持线粒体的形态具有重要意义[12]。线粒体分裂/融合由一系列线粒体跨膜GTP酶类蛋白质所调控,其中包括介导分裂的动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)和线粒体外膜分裂蛋白(fission protein 1,Fis1),介导融合的视神经萎缩因子1(optic atrophy 1,OPA 1)、线粒体融合蛋白 1(mitofusin 1,MFN1)和 MFN2。研究证明,线粒体分裂是线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction,MtD)的起始因素[13],且线粒体功能障碍参与了阿霉素(adriamycin,ADR)导致的足细胞损伤,改善线粒体功能可显著改善足细胞标志物Nephrin、Podocin的表达、抑制足细胞凋亡[14]。因此我们设想,金丝桃苷是否可以通过抑制足细胞线粒体分裂、保护线粒体功能,从而缓解足细胞损伤。为此,我们将通过体内实验及体外实验两方面在阿霉素导致的足细胞损伤模型中验证以上假说,本研究分为两部分,分别以金丝桃苷对小鼠阿霉素肾病的保护作用和Drp1介导的线粒体分裂在阿霉素导致的足细胞损伤中的作用进行论述。第一部分 金丝桃苷对小鼠阿霉素肾病的保护作用目的:探讨金丝桃苷对阿霉素导致的小鼠阿霉素肾病的保护作用。方法:将40只8周雄性Balb/c小鼠(22-28g)随机分为4组:正常对照(Control)组、金丝桃苷(HYP)组、阿霉素(ADR)组、金丝桃苷+阿霉素(ADR+HYP)组,每组10只。ADR组及ADR+HYP组均一次性经尾静脉注射ADR 10mg/kg,HYP组及ADR+HYP组自ADR注射后第二天开始连续腹腔注射HYP 20mg/kg,共14天。于第5、14天将小鼠置于代谢笼,留取24小时尿液检测尿微量白蛋白。第15天处死小鼠,留取肾皮质标本检测足细胞标志分子、线粒体分裂相关蛋白分子,HE染色观察肾脏病理变化。Realtime-PCR检测Drp1基因水平表达、线粒体DNA(mtDNA)表达。组织活性氧(ROS)染色观察ROS表达、共聚焦显微镜观察Drp1与足细胞标志分子定位。结果:(1)ADR导致小鼠尿微量白蛋白增加(P<0.05),肾脏病理显示肾小球基质及系膜细胞增加、球囊黏连、血管袢闭塞,小管可见蛋白管型。HYP减轻小鼠尿微量白蛋白排泄(P<0.05)。肾脏病理小球病变明显减轻,蛋白管型少。(2)电子显微镜可观察到ADR组小鼠肾脏广泛的足细胞足突融合。足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin、Podocin在蛋白水平及基因水平表达量均减少。ADR导致的足细胞损伤可被HYP抑制,电子显微镜下足突融合减少。足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin、Podocin在蛋白水平及基因水平表达量较单纯阿霉素处理组明显增加(P<0.05)。ADR组小鼠肾组织ROS表达量增高,HYP干预后组织ROS表达明显下降。ADR组小鼠肾组织mtDNA表达减少(P<0.05)可被HYP抑制。(3)ADR促进小鼠肾脏线粒体分裂,线粒体分裂蛋白Drp1表达量增加,线粒体融合蛋白Mfn-1表达量减少。激光共聚焦下Drp1定位与足细胞裂孔隔膜蛋白Synaptopodin一致,且Drp1荧光强度明显增强,Synaptopodin荧光强度减弱。经HYP处理14天后,Drp1表达量减少,Mfn-1表达增加。激光共聚焦下Drp1荧光强度减弱,Synapotodin荧光强度恢复。结论:阿霉素导致小鼠产生尿白蛋白增多、足细胞损伤及线粒体分裂增加。金丝桃苷可减轻阿霉素导致肾脏损伤作用。第二部分 金丝桃苷对阿霉素导致体外培养足细胞损伤的保护作用及其机制研究目的:探讨金丝桃苷在阿霉素导致的人足细胞损伤的中的作用及其机制。方法:体外培养人足细胞,研究阿霉素(ADR)的浓度效应(0、0.25、1、5ug/ml)及时间效应(0、6、12、18h)。金丝桃苷(HYP,50μmol/L)预先 60分钟加药,或线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1,10μmol/L)预先30分钟加药,分别与ADR共处理人足细胞12h后,western blot检测足细胞标志分子Nephrin、Podocin表达;线粒体分裂与融合蛋白Drp1、Mfn-1;线粒体合成相关蛋白PGC-1α的表达。鬼笔环肽染色共聚焦显微镜观察细胞骨架改变;Mitotracker Red染色观察线粒体形态变化;测定活性氧(ROS)、线粒体活性氧(MitoSOX)、线粒体膜电位(JC-1)。流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:(1)ADR导致的足细胞损伤呈时间及齐U量依赖性,ADR浓度为0.25ug/ml时Nephrin表达下降即有统计学差异(P<0.05),5ug/ml时达高峰。ADR干预6小时后Nephrin表达出现下降趋势,干预12小时后Nephrin下降有统计学差异(P<0.05)。(2)流式细胞术检测发现ADR导致的足细胞凋亡增加(P<0.05)可被HYP抑制。HYP抑制ADR导致的足细胞Nephrin、Podocin减少,抑制ADR导致的细胞骨架重塑。(3)HYP上调足细胞PGC-1α的表达(P<0.05),促进细胞线粒体合成,并抑制ADR导致的mtDNA减少(P<0.05)。共聚焦显微镜下观察,HYP预处理的细胞ROS表达减少,荧光酶标仪定量检测差别达统计学差异(P<0.05)。ADR组线粒体活性氧(MitoSOX)荧光强度增加,流式细胞术定量检测差别达统计学差异(P<0.05)。JC-1染色显示ADR组线粒体膜电位下降,经HYP干预后可恢复线粒体膜电位。(4)Western blot检测ADR组Drp1蛋白水平表达增加(P<0.05),p-Drp1(ser637/616)及 Mfn-1 表达减少(P<0.05),这一现象可被HYP抑制。共聚焦显微镜下ADR组细胞线粒体形态以片断状、颗粒状为主,HYP预处理后细胞线粒体形态恢复以长管状为主。(5)线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)与ADR共同干预细胞后,Drp1表达下调(P<0.05)、Mfn-1及p-Drp1表达上调(P<0.05)。共聚焦显微镜下细胞线粒体形态以长管状为主。Nephrin表达较单纯ADR干预组上调(P<0.05)。结论:阿霉素导致足细胞损伤呈时间及剂量依赖性,导致足细胞线粒体功能障碍、线粒体分裂增加。金丝桃苷抑制ADR导致的足细胞损伤、足细胞线粒体功能障碍及线粒体分裂增加。使用线粒体分裂抑制剂可得到相似的结果,证明HYP通过抑制线粒体分裂保护足细胞。