急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是临床常见的危重症,是各种原因引起的急性肾脏功能下降、伴或不伴有少尿或无尿的一种临床综合征,病死率较高,AKI也是引起慢性肾功能不全(ESRD)的重要原因,对患者的生命安全造成严重威胁。因此,研究AKI肾脏损伤相关机制,对早期防治AKI及ESRD具有重要意义。在AKI过程中,肾小管上皮细胞是主要受损细胞,主要表现为小管细胞去分化,上皮细胞标志消失,细胞极性消失,细胞凋亡甚至坏死。micro RNA是一类广泛存在于真核生物中长2l~25碱基的非编码微小RNA,通过与靶基因3’UTR结合从而抑制其转录,调节蛋白编码基因的表达,涉及包括发育、细胞增殖和分化以及凋亡等广泛的生物学过程。多项研究证实micro RNA与急慢性肾损伤的发生发展有着密切的联系。本课题组前期在醛固酮灌注小鼠模型的肾皮质组织中发现mi R-709较正常对照组明显升高。有研究发现,肝脏中mi R-709随年龄的增长其表达逐渐增加。mi R-709在急性肾损伤中的作用还未见报道。线粒体是合成ATP、电子传递和氧化磷酸化的主要场所。线粒体功能障碍在肾损伤中的作用已得到广泛关注。业已证明,在缺血再灌注及肾毒性药物所致的急性肾损伤模型中,均存在线粒体形态异常、线粒体DNA突变、线粒体DNA拷贝数下降以及细胞凋亡。本课题组前期研究发现线粒体功能障碍是醛固酮小鼠肾损伤模型、顺铂(cisplatin)急性肾损伤模型的早期事件。本实验在前期研究的基础上,通过顺铂诱导急性肾小管上皮细胞损伤,观察mi R-709表达变化;调控mi R-709的表达水平,观察其在肾小管上皮细胞损伤中的作用及其分子机制。研究共分为三部分:mi R-709在顺铂诱导急性肾小管上皮细胞损伤中的表达变化及mi R-709过表达、抑制对肾小管上皮细胞凋亡、上皮细胞标志蛋白、急性肾损伤标志物表达及线粒体功能的影响;肾小管上皮细胞中mi R-709靶基因的筛选与鉴定。研究mi R-709在顺铂诱导急性肾小管上皮细胞损伤中的作用并探讨其可能机制,从而为急性肾损伤的发病机制、治疗靶点提供新的思路。第一部分micro RNA-709在顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤中的表达及作用目的:观察mi R-709在顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤中的表达及作用。方法:体外培养小鼠肾小管上皮细胞,应用不同剂量的顺铂(0、1、5、10、20μmol/L)刺激24h或10μmol/L剂量的顺铂刺激不同时间(0、2、6、12、24h)。采用实时荧光定量PCR检测肾小管上皮细胞内mi R-709的表达变化。应用LipofectamineTM 2000转染mi R-709 mimic或mi R-709 inhibitor。mi R-709过表达实验分组为:NC(negative control)过表达对照组、mi R-709 mimic(过表达mi R-709)组;mi R-709表达抑制实验分组为:INNC(inhibitor negative control)下调对照组,mi R-709 inhibitor(下调mi R-709)组,INNC+cisplatin,mi R-709inhibitor+cisplatin。流式细胞仪检测细胞凋亡数目;分光光度法检测凋亡相关分子caspase-3的底物活性;应用实时荧光定量PCR和western blot法分别检测肾小管上皮细胞连接蛋白E-cadherin、急性肾损伤标志物肾损伤分子(KIM-1)和中性粒细胞明胶酶运载蛋白(NGAL)m RNA和蛋白表达。结果:(1)顺铂可呈剂量及时间依赖性诱导肾小管上皮细胞mi R-709的表达。与对照组相比,5μmol/L顺铂刺激肾小管上皮细胞24h后,mi R-709表达开始升高(升高2.15倍),10、20μmol/L顺铂刺激24h mi R-709分别升高5.35倍、5.7倍,均P<0.05;肾小管上皮细胞经10μmol/L顺铂刺激12h后mi R-709升高1.63倍,24h升高达高峰(升高5.3倍);(2)过表达mi R-709肾小管上皮细胞凋亡及caspase-3活化显著增加(分别增加0.54倍、0.31倍,均P<0.05),E-cadherin表达减少(减少59.3%),急性肾损伤标志物KIM-1、NGAL表达增加(分别增加0.4倍、0.62倍,均P<0.05);(3)下调mi R-709可减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡、caspase-3活化、E-cadherin表达下降及KIM-1和NGAL表达增加。结论:顺铂呈剂量及时间依赖性地诱导肾小管上皮细胞中mi R-709的表达;过表达mi R-709可诱导肾小管上皮细胞损伤,下调mi R-709对顺铂诱导的急性肾小管上皮细胞损伤具有保护作用。第二部分micro RNA-709对顺铂诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍的影响目的:明确miR-709对顺铂诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍的影响。方法:体外培养小鼠肾小管上皮细胞,应用LipofectamineTM 2000转染mi R-709mimic或mi R-709 inhibitor。mi R-709过表达实验分组为:NC(negative control)过表达对照组、mi R-709 mimic(过表达mi R-709)组;mi R-709表达抑制实验分组为:INNC(inhibitor negative control)下调对照组,mi R-709 inhibitor(下调mi R-709)组,INNC+cisplatin,mi R-709 inhibitor+cisplatin。应用JC-1染色流式细胞仪结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位;流式细胞仪检测线粒体超氧化物(mitochondrial superoxide,mito SOX)生成;定量PCR检测线粒体基因(mt DNA)拷贝数;分光光度法检测线粒体途径凋亡相关分子caspase-9的底物活性。结果:(1)过表达mi R-709后肾小管上皮细胞线粒体膜电位和mt DNA拷贝数下降(分别下降34.2%、41.8%,均P<0.05),ROS生成及caspase-9活性增加(分别增加0.31倍、0.33倍,均P<0.05);(2)下调mi R-709可减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,包括减轻线粒体膜电位和mt DNA拷贝数下降、抑制ROS的生成及caspase-9的活化。结论:过表达mi R-709可诱导肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,下调mi R-709对顺铂诱导的肾小管上皮细胞线粒体障碍有保护作用。第三部分肾小管上皮细胞中micro RNA-709靶基因的筛选与鉴定目的:筛选并鉴定肾小管上皮细胞中mi R-709的靶基因,明确其介导肾小管上皮细胞损伤的分子机制。方法:体外培养小鼠肾小管上皮细胞,应用不同剂量的顺铂(0、1、5、10、20μmol/L)刺激24h或10μmol/L剂量的顺铂刺激不同时间(0、2、6、12、24h)。实时荧光定量PCR和western blot检测线粒体转录因子(mitochondrial transcription factor A,TFAM)表达变化。体外培养小鼠肾小管上皮细胞,应用LipofectamineTM2000转染pc DNA3.1-TFAM,过表达TFAM后再应用cisplatin刺激。应用RNA Hybrid软件对TFAM的3′UTR与相应的mi R-709互补结合位点的核苷酸序列的自由能进行分析。构建TFAM荧光素酶报告基因,过表达mi R-709后检测TFAM荧光素酶报告基因的活性。过表达mi R-709,应用实时荧光定量PCR和western blot检测肾小管上皮细胞TFAM m RNA及蛋白表达。进一步验证TFAM在mi R-709介导肾小管上皮细胞线粒体功能障碍及肾小管上皮细胞损伤中的作用。TFAM过表达分组为:vehicle+NC组,vehicle+mi R-709mimic组,TFAM+NC组,TFAM+mi R-709 mimic组,应用实时荧光定量PCR和western blot法验证肾小管上皮细胞线粒体转录因子TFAM的过表达;应用实时荧光定量PCR和western blot检测肾小管上皮细胞连接蛋白E-cadherin、急性肾损伤标志物肾损伤分子(KIM-1)和NGAL表达;Annexin V-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡;分光光度法检测凋亡相关分子caspase-3的底物活性;JC-1染色后流式细胞仪结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位;流式细胞仪检测线粒体超氧化物生成;定量PCR检测线粒体基因(mt DNA)拷贝数;分光光度法检测线粒体途径凋亡相关分子caspase-9的底物活性。结果:(1)顺铂呈剂量及时间依赖性抑制肾小管上皮细胞TFAM表达。5μmol/L顺铂刺激肾小管上皮细胞24h后TFAM表达下降(下降34.2%),10、20μmol/L顺铂刺激后分别下降66.3%,67.9%,均P<0.05;肾小管上皮细胞经10μmol/L顺铂刺激12h后TFAM表达下降23.1%,24h后下降更显著(下降52.3%)。(2)过表达TFAM可减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡及线粒体功能障碍。TFAM过表达组顺铂诱导的细胞凋亡和caspase-3活化显著降低,同时顺铂诱导的线粒体功能损伤指标包括线粒体膜电位和mt DNA拷贝数降低、ROS产生及线粒体途径凋亡相关分子caspase-9活化均得到了抑制。(3)肾小管上皮细胞中mi R-709靶基因TFAM的鉴定:RNA Hybrid软件在线分析TFAM的3′UTR与mi R-709互补结合位点的核苷酸序列的最小自由能是-27.1kcal/mol,低于随机平均自由能阈值;荧光素酶报告实验发现过表达mi R-709可以降低pmir GLO-TFAM 3′UTR-WT的荧光素酶活性,其活性下降了32.5%,而pmir GLO-TFAM 3′UTR-MUT与mi R-709 mimic共同转染小管上皮细胞其荧光素酶活性没有明显变化;过表达mi R-709后,TFAM的m RNA和蛋白水平均明显下降(分别下降68.1%,40%,均P<0.05)。(4)TFAM过表达可阻断mi R-709介导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍和肾小管上皮细胞损伤。结论:mi R-709通过靶向调控TFAM的表达负性调控线粒体功能参与肾小管上皮细胞损伤。