卵巢上皮性癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一,死亡率居妇科恶性肿瘤之首,亦是导致女性死亡的第五位病因。卵巢癌的病理类型复杂,且具有易于转移和广泛播散的生物学行为,预后极差。卵巢上皮性癌包括卵巢浆液性癌、子宫内膜样癌及粘液性癌三种主要亚型,其发生机制至今尚不清楚,已越来越受到研究人员的重视。同源盒基因(homeobox gene, HOX)是指一类含有一段180 bp高度保守同源盒序列的基因。哺乳类动物的HOX基因分两大类:一类成簇地排列在不同染色体上,按照胚胎发育期的前-后轴方式(A-P)表达,称Ⅰ类HOX基因;另一类散在分布于不同染色体上,称为非Ⅰ类HOX基因。近年来许多研究表明,同源盒基因的异常表达与白血病、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌(包括Wilms瘤)等癌症的发生密切相关。我的既往研究结果表明(Cheng W, et al. Nature Medicine, 2005): HOXA9、HOXA10、HOXA11的异常表达与卵巢癌的三种主要亚型(卵巢浆液性癌、子宫内膜样癌及粘液性癌)的发生相关。其中HOXA10特异性地与卵巢子宫内膜样癌的发生相关。DNA甲基化改变在各种肿瘤包括卵巢癌的发生过程中起重要作用。DNA甲基化所致基因失表达及去甲基化所致的基因表达增强是表观遗传学上研究最深入的机制,现已确切证明基因启动子异常甲基化与肿瘤的发生关系密切,基因启动子区CpG岛甲基化可影响转录因子与其识别序列结合,直接抑制基因表达。Yoshida等指出HOXA10在子宫内膜癌中表达下调与肿瘤恶性程度紧密相关,并与HOXA10启动子区甲基化有关。因此我们设想: HOXA10在卵巢癌中的高度表达,可能与HOXA10基因的异常甲基化有关。本研究观察了HOXA10基因启动子区低甲基化改变与卵巢上皮性癌发生的相关性,为临床预防和诊断卵巢癌提供一个新思路。同时,近年来有文献报道,孕激素可抑制卵巢癌细胞增殖,促进细胞凋亡。孕激素类药物之一醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate, MPA),可作为绝经期妇女激素替代疗法中孕激素的组分,也可用作避孕药物,或用来治疗子宫内膜异位症、痛经和闭经。PI3K/Akt通路作为细胞生存信号通路重要的调控位点,在细胞生存和凋亡调控过程中发挥重要作用。孕激素很可能通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路发挥其诱导凋亡的作用。卵巢癌发病机制可能与PI3K/Akt表达或功能异常存在关联,大部分卵巢癌中都出现Akt过表达现象。PI3K/Akt信号转导通路是Bcl-2介导的细胞凋亡通路的上游调控程序之一, PI3K/Akt通路活化状态直接影响细胞的增殖和凋亡。大样本的流行病学研究和长期的临床实践均表明,孕激素可以拮抗雌激素的作用,保护卵巢,预防卵巢癌的发生。但是否可将孕激素作为辅助药物运用于卵巢癌的临床治疗目前还没有达成共识。本项研究尝试探索醋酸甲羟孕酮体外诱导卵巢癌细胞凋亡可能存在的机制,为孕激素治疗卵巢癌提供新的理论依据。第一部分HOXA10基因启动子区低甲基化改变与卵巢上皮性癌发生的相关性及其作用机制目的:1.通过观察HOXA10基因在卵巢上皮性癌中的高表达,探讨其在卵巢上皮性癌发生中的作用。2.进一步探索HOXA10基因启动子区低甲基化改变导致的HOXA10基因高表达在卵巢上皮性癌发生中的作用机制,并分析HOXA10基因低甲基化与卵巢上皮性癌临床病理因素的关系。3.研究甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’脱氧胞苷(5-Aza-dC)对卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3和HEY的作用,为5-Aza-dC治疗卵巢上皮性癌提供实验依据。方法:1.抽提卵巢上皮性癌和正常卵巢组织中的RNA及蛋白。用RT-PCR法检测HOXA10基因mRNA表达量变化;用免疫印迹法(Western Blot)检测各组织中HOXA10蛋白表达水平。2.抽提卵巢上皮性癌和正常卵巢组织中的DNA。采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific polyerase chain reaction, MSP)分析HOXA10启动子区低甲基化状态。3.卵巢上皮性癌细胞株:SKOV-3和HEY分别接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养24h后,换无血清培养基继续培养24h,分别加入0.5、5、50μmol/L 5-杂氮-2’脱氧胞苷(5-Aza-dC),药物作用24h、48h、72h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞生长增殖。同时分别提取细胞株RNA,用Real-Time PCR法检测HOXA10基因mRNA表达量变化。结果:1.RT-PCR实验结果显示: HOXA10基因mRNA在几乎所有的卵巢上皮性癌中阳性表达,但在正常卵巢组织中表达减少甚至缺失; WB实验结果显示: HOXA10蛋白在卵巢上皮性癌中高表达,而在正常卵巢组织中表达降低。2.用MSP法检测29例卵巢上皮性癌组织样本中,有17例组织中HOXA10启动子区发生低甲基化;而在16例正常卵巢组织中,仅4例组织中HOXA10启动子区发生低甲基化,差异有统计学意义(p<0.05)。HOXA10基因甲基化与卵巢上皮性癌的病理类型、临床分级无关,但与临床期别有关。结合第一部分实验,我们分析得出以下结果: (1)在正常卵巢组织中HOXA10基因启动子区处于正常的甲基化状态,而在大部分卵巢上皮性癌组织中HOXA10基因启动子区发生低甲基化。(2)HOXA10基因在卵巢上皮性癌中阳性表达,而在正常卵巢组织中表达降低甚至缺失。(3)对比HOXA10启动子区发生甲基化和低甲基化的卵巢组织(包括正常卵巢组织和卵巢上皮性癌组织)时发现: HOXA10基因mRNA及蛋白在发生甲基化的组织中表达降低,而在发生低甲基化的组织中表达升高。3.在卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3中, HOXA10基因启动子区表现为甲基化状态,运用去甲基化试剂5-杂氮-2’脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理细胞株后,卵巢癌细胞株SKOV-3中HOXA10基因的表达升高; MTT法检测发现经5-Aza-dC处理后SKOV-3细胞增殖速度增加。结论:1.特异性甲基转移酶DNMTs抑制剂—5-Aza-dC通过改变卵巢上皮性癌细胞中HOXA10启动子区甲基化状态,从而影响细胞的增殖状态。2.在卵巢上皮性癌中, HOXA10基因启动子区低甲基化改变导致了HOXA10基因在转录和翻译水平的表达升高,从而参与了卵巢上皮性癌的发生。第二部分MPA体外诱导卵巢上皮性癌SKOV-3细胞株凋亡的研究目的:1.观察MPA在体外对卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3增殖的抑制作用。2.探索MPA诱导SKOV-3细胞凋亡的机制。3.进一步探究孕激素细胞膜受体在诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡中的作用。方法:1.卵巢上皮性癌SKOV-3细胞株接种于盛有含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的96孔板中常规培养至贴壁后,换无血清培养基继续培养24h,分别加入0.1、1、10、100μmol/L的MPA,药物作用12h、24h、48h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞生长增殖。2.卵巢上皮性癌SKOV-3细胞株接种于盛有含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的96孔板中常规培养至贴壁后,换无血清培养基继续培养24h,分别加入1、5、12.5、25μmol/L的LY294002(PI3K抑制剂)孵育1h后,再分别加入0.1、1、10、100μmol/L的MPA,药物作用12h、24h、48h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)色法检测细胞生长增殖。3.收集不同浓度MPA作用24h后的SKOV-3细胞,裂解细胞提取总蛋白, Western Blot法检测各组织中Akt、p-Akt及Bcl-2蛋白表达水平。4. SKOV-3细胞经不同浓度MPA分别作用24、48h, Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:1.MPA以时间-剂量依赖方式抑制SKOV-3细胞的体外增殖,药物作用时间越长、药物浓度越大,对细胞的毒性作用越明显(P<0.05)。2.MPA抑制SKOV-3细胞的体外增殖作用可被LY294002所阻断。3.随着MPA使用剂量的增大, SKOV-3细胞内p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平逐步下降(P<0.05)。与对照组相比,醋酸甲羟孕酮浓度为0.1μmol/L时p-Akt表达量下降约28%, Bcl-2表达量下降约10%;当醋酸甲羟孕酮浓度上升至100μmol/L时, p-Akt表达量下降约35%, Bcl-2表达量下降约27%。不同药物浓度组间Akt表达水平无明显变化(P>0.05)。4.MPA以时间-剂量依赖方式诱导SKOV-3细胞凋亡,对比不同时间的统计数据可发现, MPA作用时间为24h时早期凋亡率较晚期凋亡率上升明显(P< 0.05);当药物作用延长至48h后,晚期凋亡在凋亡总体中所占比重上升,早期凋亡上升趋势不明显。结论:1. MPA以时间-剂量依赖方式抑制SKOV-3细胞的体外增殖。2. MPA可抑制PI3K/Akt信号转导通路的激活,降低细胞内游离的Bcl-2的水平,体外诱导SKOV-3细胞发生凋亡。3. MPA浓度为1μmol/L~10μmol/L,药物作用时间为24h时,细胞对药物最为敏感,抑制细胞增殖促进细胞凋亡的作用最强;再加大药物浓度或延长药物作用时间不能明显提高细胞的凋亡率。