人类基因组测序计划完成后，蛋白质组学研究被提上了日程。蛋白质组学包括表达蛋白质组学和功能蛋白质组学两部分内容。表达蛋白质组学研究基因编码所有蛋白质的识别和定量，及其在细胞中的定位和在后转录阶段进行的修饰。而功能蛋白质组学主要研究蛋白质之间的相互作用，确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用，说明蛋白质结构和功能间的相互关系。识别蛋白质其实是对生物体内所有表达蛋白质种类的测定，鉴于复杂生物体表达蛋白质有几十万种，有效的分离蛋白质混合物对于后序正确的鉴定极为重要。两维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-D Gel)是利用蛋白质等电点和分子量的差别进行正交分离的分析方法。从1975年建立至今因其无法比拟的高分辨率在蛋白质组学的研究中始终占据重要地位。然而2-D Gel也有一些难以克服的缺陷，比如有限的动态范围和分离样品中分子量差别较大的蛋白质，低含量的蛋白质(如信号蛋白和转录因子)以及疏水性蛋白质(膜蛋白和跨膜蛋白)能力较差，另外其操作过程费时费力，自动化程度低，并且难于实现与质谱的直接联用。在大规模高通量研究蛋白质组学的今天，2-D Gel这些缺陷日益明显地限制了它更为广泛的应用。快速，高效，自动化程度高的新型分离技术亟待发展与应用。近年来，高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的发展为蛋白质和多肽的分离分析提供了新手段。然而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限，为了对复杂蛋白质样品进行更有效地分离分析，研究者尝试联用色谱电泳等分离手段以提高分辨率。与一维分离模式相比，多维分离技术的最大特点是拥有更大的峰容量。根据Giddings建立的数学模型，多维分离系统的峰容量应为其包含各单维分离模式峰容量的乘积。即如果联用的n维峰容量分别为N1，N2……Nn，则总峰容量为N1×N2…Nn。极大的峰容量对于有效分离复杂样品是十分有利的。多维色谱分离平台建立过程中最重要的两方面一是选用何种分离模式联用，二是如何实现联用。各种分离模式只有分离机理正交才能最大限度的提高峰容量，同时也要兼顾到不同分离模式所适用样品，使用流动相间的匹配问题。如何实现联接不仅包括分离模式内部的联接，最后一维与检测器的联接也要考虑在内。一维色谱及电泳分离模式多样，多维联用可在色谱内部，电泳内部及色谱电泳之间进行。研究者要根据实验室的具体情况及样品来选择合适的联用模式，并实现联接以应用于实际分析。无论是2-D Gel还是多维色谱分离技术，蛋白质样品经过分离后都要进入生物质谱进行鉴定。生物质谱常采用的两种电离技术是电喷雾电离(ESI)和基体辅助激光诱导解吸电离(MALDI)。分离后的肽段或蛋白质离子化后进入质谱，进行相应的质量分析，所得数据送入蛋白质数据库搜索并获得相应的蛋白质身份。建立多维色谱分离平台，并将之与生物质谱联用以分析生物体组织或细胞蛋白质表达谱是本论文所涉及的最重要的工作。论文第一章对多维分离技术进展进行了综述，主要包括由不同单维分离模式组成的两维及三维分离系统及其在蛋白质组学研究中的应用。第二章建立并优化了在线两维液质联用分离分析系统，并应用于肝脏样品和肝脏细胞核表达蛋白质组的分析。利用标准蛋白质混合样品对SCX-RPLC两维系统的检测限和分离能力进行了考察，分别优化了强阳离子交换台阶式盐进样洗脱条件和反相分离所采用的连续梯度洗脱条件，比较了商品预柱与实验室自制预柱对样品的捕捉及富集能力，并将自制预柱替代商品预柱用于实际样品分析。利用nano-flow 2-D LC-MS／MS系统对顺序提取的鼠肝蛋白质样品进行了鉴定，水溶性蛋白质鉴定出450个，尿素提取部分鉴定出339个，共鉴定出687个蛋白质；同时利用该系统分析了C57小鼠肝脏核蛋白质表达谱，五次并行分析共鉴定得到462个蛋白质。第三章发展了ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS并行鉴定技术，并与两维液相分离联用以分析复杂蛋白质样品。MALDI与ESI离子化机理显著不同，两者对同一样品进行分析时，获得的信息既可相互确认又能形成补充。目前为止没有质谱可同时进行ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS测定，我们发展的并行鉴定技术旨在实现ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS同时检测，从而挖掘出更全面的样品信息。实验中利用柱后分流将ESI-MS／MS和MALDI-MS／MS连接到同一色谱分离过程之后，一部分进行ESI-MS／MS分析，另一部分点样在MALDI靶板上利用MALDI-MS／MS分析。利用该并行鉴定系统对人肝组织蛋白质提取样品进行了测定，实验结果显示并行鉴定技术无论在蛋白质鉴定数量还是可信程度上都优于单独串级质谱分析。第四章发展了反相液相色谱毛细管电泳串级质谱平台。首次实现了RPLC-CZE两维系统与串级质谱的联接并将之应用到实际生物样品分离鉴定工作中。利用自行发展的重力进样接口和CZE-MALDI接口联接RPLC，CZE和MALDI-MS。传统LC-CE接口使用时，电泳两端只能施加负高压，我们所设计的新型RPLC-CZE进样接口可在正高压下使用，它与CZE-MALDI接口一起保证在进行快速电泳分离的同时电泳流分可持续稳定地点在MALDI靶板上。快速两维系统工作条件包括接口操作条件，电泳分离条件，点样频率等进行了优化。整个两维体系的分离时间只相当于一维反相分离所需时间，而峰容量比一维反相提高了约一个数量级。利用该快速全二维分离鉴定系统，我们分析了肝癌高转移潜能小鼠肝脏表达蛋白质，90分钟分离获得1350张串级质谱图，鉴定了2000条信噪比大于20的肽段和384个蛋白质，鉴定结果显示了RPLC-CZE-MALDI-MS／MS分离分析平台在快速高通量蛋白质组学研究中的应用潜力。第五章构建了SEC-SCX-RPLC-ESI-MS／MS三维分离分析平台。此体系在SCX-RPLC-MS／MS两维鉴定平台上发展而成，通过引入SEC分离模式提高整个多维分离系统的峰容量和上样量，从而解决两维系统对复杂蛋白质样品分离不充分而导致蛋白质鉴定数量和可信度难以提高的问题。新一维分离模式的引入，考虑其对样品是否有歧视效应，分离机理与后两维是否正交，模式是否兼容等因素。体积排阻色谱(SEC)依据分子量分离，对样品无歧视效应，其流动相可依据样品性质在酸性、中性、碱性溶液或有机溶剂中选择，甚至可加入变性剂或表面活性剂增溶以提高方法重现性。具体实验中可采用两种技术路线。第一条路线中先由SEC分离蛋白质，按色谱峰收集流出组分，冻干，酶解，各组分经过SCX-RPLC两维色谱分离后在线进行ESI-MS／MS分析；第二条路线是先酶解蛋白质成为肽段，再以SEC-SCX-RPLC三维系统分离，流出肽段进行串级质谱鉴定分析。新一维SEC分离模式的引入在提高系统峰容量的同时，也增加了系统上样量，有利于对为数众多的低丰度蛋白质鉴定。论文中分析比较了上述两条技术路线的分离鉴定结果，发现采用第一条路线即蛋白质层次分级分离在检测蛋白质数量及可信度方面效果更好。该三维分离分析平台被应用到人肝蛋白质表达谱测定工作中，以＞95％置信水平鉴定得到1624个蛋白质，对于鉴定结果的生物信息学分析显示鉴定蛋白分布在不同细胞器中，发挥不同分子功能并参与多种生理过程，进一步说明该三维分离分析平台可大幅度提高复杂蛋白质样品的分离及鉴定能力。