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目的:梗阻性黄疸（Obstructive jaundice）是普通外科常见疾病,可由炎症、结石、肿瘤等多种病因引起,导致肝内外的胆管完全或者部分的机械性梗阻,引起胆汁排入肠道的过程受阻,进而出现胆汁淤滞、胆红素反流入血引起的黄疸。梗阻性黄疸常引起肝功能改变和胆道感染,及时的外科治疗尤为重要。目前针对梗阻性黄疸的外科手术已经向着微创化方向发展,微创胆道手术具有创口小、疼痛轻、恢复快的特点,给患者带来了福音,同时也符合当代医学“微创精准（Minimally invasive and precise）”、“快速康复（Fast track）”的新理念。但是仍有很多不能耐受手术的患者需要较长时间使用胆汁外引流术,包括外科手术留置的T管和各种介入、内镜手术留置的引流管,这些操作可以在急诊状态下挽救患者生命,但临床观察到这部分患者的肠源性感染的发生率会升高,并可威胁患者的生命。目前,关于外引流术后胆汁丢失对肠粘膜屏障的影响及机制尚未充分明确,有待深入研究。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）是一种单脂磷酸水解酶,参与人体的能量代谢。它广泛分布于多个组织器官中,该酶属于同源二聚体。在肠管中位于肠粘膜的刷状边缘,能够水解单磷酸脂,称为肠碱性磷酸酶（Intestinal alkaline phosphatase,IAP）。生理状态下溶血卵磷脂能特异性的促进IAP向肠腔内释放。IAP具有维持肠粘膜细胞间的紧密连接蛋白的作用。研究显示,IAP可以诱导闭锁小带蛋白1（Zonula occludens-1,ZO-1）、闭锁小带蛋白2（Zonula occludens-2,ZO-2）、闭锁蛋白（Occludin）,水闸蛋白（Claudin）表达水平的升高。而闭锁蛋白、水闸蛋白、闭锁小带蛋白参与构成紧密连接复合物,起到维持正常的肠粘膜屏障功能的作用。各种紧密连接蛋白的低表达可损害肠粘膜屏障功能,进而影响肠粘膜通透性。肠道细菌、内毒素、炎性介质等会通过受损的肠粘膜屏障进入内环境,导致更多炎性介质的释放,激活全身炎症反应综合征的进程,循环损害肠粘膜屏障功能,最终导致多脏器功能衰竭的发生。鉴于胆汁丢失后肠粘膜功能障碍中IAP的作用尚未见明确报道,本研究拟明确:（1）胆汁丢失后肠粘膜屏障的形态及功能变化。（2）胆汁丢失后IAP的变化及外源性IAP治疗后对肠粘膜功能的影响。（3）进一步明确IAP在维护肠粘膜屏障功能的作用机制及与MLCK/pMLC信号通路的影响。研究方法:第一部分:我们选取8-10周龄的SD大鼠,通过外科手术的方法制备SD大鼠的胆汁丢失动物模型。将SD大鼠平均分成5组,包括:假手术组（10只）,梗阻性黄疸组（10只）、胆汁外引流组（10只）、梗阻性黄疸组+IAP饲养组（10只）、胆汁外引流+IAP饲养组（10只）。大鼠按不同条件饲养14天后,麻醉下处死动物,采取肠粘膜标本和门静脉血液标本。研究方法:（1）大鼠的一般状况观察,并记录体重变化。（2）HE染色观察肠粘膜的形态变化。（3）电镜观察肠粘膜细胞超微结构的变化。（4）小肠粘膜通透性试验检测大鼠肠粘膜的通透性改变。（5）同时收集大鼠的肠粘膜细胞,检测氧化应激指标丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及抗氧化指标还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione,GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的变化。（6）检测大鼠肠粘膜IAP和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白表达。（7）免疫组化染色观察ZO-1在组织中的分布。第二部分:体外培养的Caco-2细胞间具有紧密连接结构、排列生长具有极性,与人类肠粘膜功能相似,常用于药物吸收排泄实验,因此我们选择体外培养的Caco-2细胞系建立肠粘膜屏障模型。检测方法:（1）CCK-8实验检测不同浓度的IAP（0、100、200、500、1000U/ml）对Caco-2细胞活力的影响。（2）在培养基中加入TNF-α（100ng/mL）基础上再分别加入不同浓度的IAP（200u/ml、500u/ml、1000U/ml）,在3h、6h、12h、24h测量跨上皮细胞电阻（TEER）。（3）在TNF-α（100ng/mL）基础上分别加入IAP（200u/ml、500u/ml、1000U/ml）使用FITC-dextran进行肠粘膜通透性试验。（4）Western blot检测Caco-2单层细胞在IAP（500U/ml）及TNF-α（100ng/mL）作用下紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达。（5）免疫荧光检测ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达和分布。（6）Caco-2单层细胞在IAP（500U/ml）及TNF-α（100ng/mL）作用下,测量其MDA、ROS、GSH、SOD的数值。（7）给予Caco-2细胞IAP抑制剂L-PHE预处理,再给予TNF-α（100ng/mL）及IAP（500U/ml）处理Caco-2细胞,使用Western blot检测MLCK/pMLC通路和紧密连接蛋白的变化。结果:第一部分:（1）造模后大鼠的状态变化:假手术（SH）组:大鼠早期出现了食纳变差,活动减少,皮毛色泽变差,易激惹的症状。但恢复最快,并实现了体重增长。梗阻性黄疸（OJ）组:大鼠的巩膜黄染,解剖发现胆总管结扎近端增粗,肝脏肿大并出现硬化改变,该组大鼠体重恢复缓慢。胆汁外引流（ED）组:大鼠毛发粗糙无光泽,活动少,伴有腹泻症状,胆道引流管有大量的金黄色胆汁流出,局部皮毛黄染。大鼠体重下降明显。ED+IAP组:该组同ED组大鼠一般状况大体一致,但大鼠的腹泻症状较轻,体重下降趋势较ED组缓慢,术后2周大鼠的体重高于ED组（p<0.05）。（2）OJ组和ED组均出现了大鼠小肠粘膜的异常破坏,表现为小肠绒毛缩短,变钝,可以观察到绒毛顶端间隙变宽,腺体排列变得不规则,可见杯状细胞减少,可以在固有层见到炎症细胞的浸润,粘膜层与固有层分离的表现。ED+IAP组大鼠的小肠粘膜的破坏程度较ED组轻,相应的chiu’s评分明显低于ED组。（3）ED组和OJ组大鼠肠粘膜细胞刷状缘微绒毛排列整齐,微绒毛变短。细胞间连接小体增大,细胞间连接不再紧密,细胞质不均匀,线粒体出现空泡变性。ED+IAP组大鼠肠上皮细胞排列紧密,微绒毛长度较ED组长,微绒毛排列密集、整齐。（4）ED组和OJ组大鼠血清中测得的FITC-D浓度显著高于SH组,具有统计学意义（p<0.05）。与ED组（ED组:26.24±3.42μg/ml）相比,ED+IAP组大鼠FITC-D的血清浓度明显降低（ED+IAP组:20.52±1.29μg/ml,p<0.05）。与OJ组（OJ组:28.1±1.8μg/ml）相比,OJ+IAP组大鼠血清中FITC-D浓度（OJ+IAP组:23.3±4.95μg/ml）要低于OJ组。（5）与SH组比较,OJ组和ED组肠粘膜组织中MDA、ROS显著升高,SOD、GSH含量均显著下降。IAP治疗组的MDA、ROS水平低于相应的非治疗组,SOD、GSH含量高于相应的非治疗组。（6）与SH组相比,ED组、OJ组大鼠肠粘膜IAP、ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达均有下降。ED+IAP组与ED组比较三种紧密连接蛋白的表达也均有增加（p<0.05）。OJ+IAP组与OJ组比较,三种紧密连接蛋白的表达也均有增加（p<0.05）。（7）免疫组化染色显示,SH组大鼠ZO-1蛋白均分布在肠粘膜细胞间。ED组和OJ组大鼠ZO-1蛋白表达明显低于SH组（p<0.05）。ED+IAP组、OJ+IAP组的ZO-1蛋白表达虽然有升高,但无统计学差异。第二部分:（1）CCK-8实验结果显示使用0-1000U/ml IAP处理Caco-2细胞24h,IAP对细胞活力没有影响。（2）使用100 ng/mL的TNF-α处理Caco-2细胞,各组细胞的TEER值均随时间下降,24h后TEER值达到稳定不再降低。200-1000U/ml的IAP预处理细胞明显改善了TNF-α诱导的电阻值下降（p<0.05）,并且改善值与IAP的浓度相关。（3）100 ng/mL TNF-α可以明显增加Caco-2单层细胞屏障的通透性。而IAP可以缓解TNF-α诱导的细胞屏障通透性的增加（p<0.05）。（4）500U/ml IAP可以部分缓解TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白的破坏,其光密度值与TNF-α组对比有统计学意义（p<0.01）。（5）免疫荧光法:加入100ng/mL TNF-α后24小时,Caco-2细胞间的紧密连接蛋白分布变得稀疏,并间断出现锯齿样改变。给与IAP（500U/ml）后明显增加了紧密连接蛋白的表达。（6）TNF-α能够诱导ROS、MDA的表达增加。而IAP可以明显降低TNF-α对MDA、ROS的升高作用。TNF-α诱导降低S OD、GSH的表达。而I AP明显缓解了TNF-α对SOD、GSH表达的抑制（p<0.05）。（7）IAP治疗降低了TNF-α诱导的MLCK/pMLC的表达升高,增加了ZO-1、Occludin和Claudin-1三种蛋白表达。而使用IAP的抑制剂L-PHE抑制IAP的作用,可以使MLCK/pMLC通路的两种蛋白的表达升高（p<0.05）,还可以使紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达下降（p<0.05）。结论:（1）胆汁丢失可造成肠粘膜屏障结构和功能变化。IAP可明显改善因胆汁缺失引起的小肠绒毛萎缩,紧密连接蛋白低表达,肠屏障通透性升高等肠粘膜屏障结构、功能的损伤。（2）IAP可以抑制胆汁丢失引起的肠粘膜细胞的过氧化,并提高肠粘膜细胞抗氧化应激的能力。IAP可提高胆汁丢失大鼠紧密连接蛋白的表达。IAP对胆汁丢失后的肠粘膜屏障功能损害,具有修复作用。（3）IAP可降低TNF-α诱导的肠粘膜通透性的升高和紧密连接蛋白的表达下降。IAP还可以抑制TNF-α引起的脂质过氧化,提高抗氧化能力。IAP可以通过抑制MLCK/pMLC信号通路,维持肠粘膜的屏障功能。