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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）又名“蓝耳病”。是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种接触性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。其病原具有典型的嗜单核细胞/巨噬细胞特性，在体内，PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages, PAM），在体外，主要的易感细胞是非洲绿猴肾细胞MA-104及其衍生细胞Marc-145。PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异受体结合，利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。至今，已经报道的与病毒感染相关的细胞蛋白由5个，分别为：唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）、似肝磷脂蛋白（Heparan sulphate， HS）、波形蛋白（Vimentin）、清道夫受体（CD163）和CD151蛋白。研究显示HS主要跟PRRSV与细胞的吸附相关，Sn则主要介导病毒的内吞，CD163则发挥协助Sn内吞，病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用，CD151能够与PRRSV RNA3’UTR相互作用，转染CD151表达载体至PRRSV非易感细胞能使非易感细胞感染PRRSV，而且抗CD151蛋白的血清能够完全阻断病毒感染。细胞蛋白NMHC-ⅡA与PRRSV之间的关系是基于本实验室用模拟PRRSV GP5抗原表位的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)，通过免疫共沉淀从PAM和Marc-145中获得的一个分子量约为230kD的蛋白质，后经质谱分析和测序确定为非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（Non-myscle myosin heavy chain ⅡA，NMHC-ⅡA）。在动物体内，非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMⅡ）重链有三种亚型，分别为：NMHC-ⅡA、NMHC-ⅡB、NMHC-ⅡC。此蛋白广泛分布在整个生物体内，主要与细胞的吸附，迁移和胞质分裂相关。目前关于NMHC-ⅡA功能的研究主要集中于针对其对细胞的生理功能研究，而与病毒感染之间研究鲜有可见，作为病毒受体已经有报道称NMHC-ⅡA是HSV-1的一个功能性受体，另外PRRSV的重要受体蛋白CD163已经被证明在淋巴细胞中可溶性的CD163可以与NMHC-ⅡA结合，但关于CD163在Marc-145细胞中是否与NMHC-ⅡA有相互关系，是NMHC-ⅡA和CD163共同在病毒感染过程中发挥作用还是NMHC-ⅡA能够另外独立发挥作用目前还没有报道证实。本研究针对NMHC-ⅡA与PRRSV之间的相互关系进行了以下几方面的分析：1、NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV病毒粒子体外相互作用分析为了更加明确的分析NMHC-ⅡA与病毒的相互作用关系，我们通过免疫共沉淀方法提纯Marc-145细胞内的NMHC-ⅡA蛋白和通过原核表达纯化NMHC-ⅡA截短蛋白PRA蛋白，将蛋白标记到Dynabeads (免疫磁珠)上利用蛋白-病毒pull down技术对NMHC-ⅡA蛋白病毒之间的关系进行分析。检测结果显示，NMHC-ⅡA与PRA蛋白均能捕获病毒粒子，而对照组没有出现病毒粒子检测条带。2、抗NMHC-ⅡA蛋白血清对病毒的阻断作用分析作为PRRSV的细胞受体CD163、Vimentin、Sn、CD151等蛋白的抗血清均能够有效阻断病毒感染，为了判断NMHC-ⅡA作为一个潜在受体其血清是否也能够阻断病毒感染，我们利用通过免疫共沉淀提纯的NMHC-ⅡA蛋白免疫小鼠，分离血清进行PRRSV感染阻断实验。实验结果显示血清在1:5稀释时能够有效阻断病毒感染细胞，阻断效率达到80%，随着稀释度的增加阻断效率逐渐降低，稀释度达到1:20时对病毒的阻断作用几乎消失。3、NMHC-ⅡA蛋白低表达细胞系的建立与病毒感染分析为了分析病毒感染过程中NMHC-ⅡA与PRRSV的相互关系，我们利用RNA干扰技术，设计合成4条（miRNA-1、miRNA-2、miRNA-3、miRNA-4,）针对NMHC-ⅡA基因的miRNA对NMHC-ⅡA基因表达进行沉默，分析NMHC-ⅡA表达量降低对PRRSV感染Marc-145的影响，同时设计无关的miRNA序列作为对照。通过荧光定量测定分析发现miRNA-4序列能够有效降低NMHC-ⅡA在细胞内的表达；经过抗生素和单克隆筛选获得miRNA-4载体转染能够稳定传代的细胞株P-4，该细胞株的NMHC-ⅡA表达水平与对照细胞P-NC相比降低了47%。利用该细胞株进行PRRSV感染实验，结果显示4℃条件下病毒吸附细胞的量没有因为NMHC-ⅡA蛋白表达量的降低而产生显著改变。但病毒感染后的增殖，通过TCID50测定发现NMHC-ⅡA低表达细胞的病毒滴度显著下降，病毒在24、48、72、96h的滴度分别是对照细胞的57.9%、77.7%、86.8%和87.4%。结果证明NMHC-ⅡA表达量的降低能够影响病毒的增殖。但是对病毒增殖的影响程度呈逐渐减弱趋势。4、NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV在Marc-145细胞上的共定位分析为了更直观的观察NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV在病毒感染过程中的相互关系，我们在P-4、P-NC和Marc-145细胞上对病毒吸附和内化等不同时期进行固定，对NMHC-ⅡA蛋白和PRRSV进行了双荧光染色，利用共聚焦显微镜进行共定位分析，判断两者之间在量上的相互关系以及病毒感染与时间的关系。结果显示，病毒对三种细胞的吸附没有明显差异，但病毒吸附后内化的病毒量P-4细胞要明显低于对照细胞，该差异从内化15min后开始出现。关于病毒在不同细胞上的内化与时间的关系，通过观察发现，P-4细胞与对照细胞相比较病毒内化的时间明显推迟，P-4细胞开始出现内化的时间要比对照细胞晚15min左右。从P-4、P-NC和Marc-145细胞上都可以看到PRRSV的内化过程是伴随着NMHC-ⅡA蛋白的收缩而发生的，PRRSV从膜进入细胞质并向细胞核运动的时间相对较短，并且到达细胞核周围一定距离后在一定时间内位置相对不再变化。5、NMHC-ⅡA蛋白低表达细胞生长曲线，细胞周期测定和有丝分裂观察研究已经证明非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NM-Ⅱ）在细胞内的生物学功能主要与细胞的粘附，迁移和胞质分裂相关。为了分析我们筛选的NMHC-ⅡA低表达细胞系是否会因为NMHC-ⅡA降低47%的表达而显著影响细胞的正常生理功能从而对病毒的感染产生影响。我们对该细胞进行了生长曲线测定，细胞周期测定和细胞有丝分裂观察。结果显示降低47%NMHC-ⅡA表达的细胞与对照细胞相比生长曲线没有产生明显差异，细胞周期变化分布基本一致，细胞有丝分裂能够正常进行。