论文部分内容阅读
菊花(Chrysanthemllm morifolium Ramat.)属菊科菊属，多年生草本植物，品种繁多。茶菊(Chrysanthemllm morifolium cv.‘Chaju’)是菊花中一种重要的药用品种，是河南道地药材怀菊花的主栽品种之一。怀菊花栽培历史悠久，由于长期采用无性繁殖，致使品种退化，对病害、干旱等因素的抗性减弱，培育对不良环境条件以及病虫害具有较强抵抗力的品种是目前亟待解决的问题。GhEREB2基因是从棉花体内提取的一种转录因子基因，它能够调控PR基因(PR，pathogensis related)(病原相关蛋白基因，如几丁质酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因等)和其它相关防御基因的表达，使植物对多种真菌病害和非生物胁迫表现抗性。
本实验以菊花品种茶菊为实验材料，对茶菊的再生条件和转化体系进行了研究，并用农杆菌介导GhEREB2基因对茶菊进行遗传转化，旨在建立茶菊高效的再生体系及农杆菌介导的转化体系，并获得具有对真菌病害及非生物胁迫具有广谱抗性的怀菊品种。主要内容如下：
(1)利用茶菊的叶盘、茎段为外植体，在MS培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA，研究不同激素浓度配比对菊花直接再生不定芽和不定芽生根的影响。结果表明，诱导叶盘、茎段直接再生不定芽的最适分化培养基分别是MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L和MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L；不定芽在MS、MS+NAA0.1-0.2 mg/L、1/2 MS+NAA0.1-0.2 mg/L的生根培养基上生根率均可达到100％；生根苗移栽成活率100％。优化了茶菊再生条件，建立了茶菊叶盘和茎段的高效再生体系。
(2)以叶盘为外植体，研究叶盘对潮霉素、头孢霉素的敏感性，确定转化过程中合适的抗生素筛选压和抑菌浓度。结果表明，6 mg/L潮霉素可抑制叶盘的分化，3 mg/L潮霉素即可抑制小苗的生根。20.mg/L的头孢唑啉钠对外植体分化再生影响很小，并可有效抑制农杆菌再生，可以作为转化过程中的抑菌浓度。
(3)利用农杆菌介导GhEREB2基因对叶盘进行转化，研究转化过程中预培养时间、AS的添加方式、共培养时间、延迟筛选时间四个因素对转化率的影响。结果显示，侵染时间采用8-10分钟条件下，叶盘经预培养1天，共培养2-3天，在侵染液和共培养培养基中添加10.μmol/L的乙酰丁香酮，延迟培养4天，转化效率较高。叶盘经筛选培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L+Cef20.mg/L+Hyg6 mg/L筛选培养，最后获得阳性芽31株，再把阳性芽转到生根培养基MS+NAA0.1 mg/L+Hyg3 mg/L上进行生根筛选，获得11株阳性植株；使用GhEREB2和mGFP5基因引物对阳性植株进行PCR扩增检测，并对阳性植株叶肉细胞进行荧光检测，检测结果表明，有3个植株中有目的基因存在，初步证明了目的基因GhEREB2导入并整合到茶菊基因组中。