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猪圆环病毒2型(PCV2)是近些年来危害养猪业的重要病原体之一,可以诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)在内的许多种临床上的疾病。PMWS主要表现为渐行性的消瘦、生长发育迟缓,淋巴结肿大、腹泻、皮肤苍白和黄疸。PCV2与PRRSV混合感染可以导致更加严重的症状与病变,升高死亡率。目前,疫苗接种是最有效的手段,但尚无商品化弱毒疫苗。本实验室采用PCV2SH毒株在PK15细胞连续传代至86代,命名为LP86毒株。本研究采用人工感染结合免疫刺激方法及PRRSV混合感染方法对该毒株的仔猪致病作用进行了评估。同时,采用小鼠免疫试验测定了一种新型PCV2 Cap-SS亚单位疫苗的免疫效果,为PCV2疫苗研究奠定基础。具体内容如下:1。猪圆环病毒2型LP86毒株对仔猪致病性研究本研究选取35日龄PRRSV和PCV2阴性健康仔猪,进行仔猪攻毒试验。(1)PCV2感染试验:取10头健康仔猪,随机分为2组,每组5头,第1组攻毒PCV2-LP86,第2组为PBS对照组。PCV2-LP86攻毒后第4天和第7天,在每头猪的前肢两侧腋下及后肢两侧的臀部共4个点上注射弗氏不完全佐剂混匀乳化的钥匙孔血蓝蛋白,然后注射巯基乙酸培养基到仔猪腹腔进行免疫刺激,PCV2-LP86攻毒后的第11、19天再次注射巯基乙酸培养基到仔猪腹腔。PCV2-LP86攻毒后连续观察25天,记录临床症状,计算日增重,观察病理变化,检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果显示,PCV2-LP86感染组与空白对照组未出现明显临床症状与病理变化,免疫组化检测猪腹股沟淋巴结内PCV2抗原,攻毒组只有1头出现棕黄色的阳性细胞。(2)PCV2与PRRSV共感染试验:取18头健康仔猪,设PCV2感染组(n=5头)、PRRSV+PCV2共感染组(n=5头)、PRRSV感染组(n=5头)和空白对照组(n=3头)。攻毒后每天测量体温并观察临床症状21天,每周采血,第0天与剖杀前称量体重,计算相对日增重。所有猪剖杀后观察病理变化,采用荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果显示:①PCV2-LP86单独感染组与空白对照组未出现明显症状。PRRSV+PCV2-LP86共感染组与PRRSV单独感染组在攻毒后均出现高热萎靡,最高体温可达41℃以上,PPRSV组死亡1头。发病后期两组体温恢复但出现了拉稀现象。②PCV2-LP86单独感染组与空白对照组无明显病变,PRRSV+PCV2-LP86共感染组与PRRSV单独感染组均存在明显间质性肺炎,相差不明显。③PCV2-LP86 组血清 PCV2 含量高于 PRRSV+PCV2-LP86 组,PRRSV+PCV2-LP86组血清中PRRSV含量与PRRSV组基本一致。④PCV2-LP86组淋巴结中PCV2含量与PRRSV+PCV2组相似,PRRSV+PCV2-LP86共感染组肺脏中PRRSV载量与PRRSV单独感染组无显著差异。该研究表明PCV2-LP86毒株对仔猪致病性较弱。2.猪圆环病毒2型Cap-SS亚单位疫苗制备与小鼠免疫效果测定本研究采用表达PCV2 Cap蛋白和生长抑制激素多肽(SS)的7种大肠杆菌表达质粒,pET-32a-Capm-SS、pET-32a-SS-Capm、pET-32a-SS-Cap△10、pET-28a-SS-Capm、pET-28a-Capm-SS、pRSET-Capm-SS 和 pRSET-SS-Capm,分别于大肠杆菌获得可溶形式表达,制备纯化重组蛋白,经过Cap抗体和SS抗体Western blot鉴定,证明 pET-32a-Capm-SS、pET-32a-SS-Capm、pET-32a-SS-Cap△10 表达的重组蛋白表达量较大且具有较好反应特异性。将Capm-SS、SS-Capm、SS-Cap△10重组蛋白分别与A101复合佐剂混合制备疫苗,两次免疫小鼠,首次免疫后第14天和28天尾尖采血,检测PCV2ELISA抗体效价,第0、14、28、42和56d称量所有小鼠体重,计算各组小鼠相对日增重。结果显示,首次免疫后两周,SS-Capm和SS-Cap△10的A101佐剂免疫组即可诱导ELISA抗体,所有疫苗两次免疫2周后可以诱导小鼠产生较高水平的PCV2 ELISA抗体。与PBS组比较,疫苗免疫组可以促进小鼠生长,其中SS-Cap△10疫苗组效果更佳,为PCV2新型疫苗研制奠定了基础。