【摘 要】
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背景黄韧带肥厚是腰椎椎管狭窄的一个重要因素,严重时会压迫神经根和马尾,导致腰部疼痛及间歇性跛行。尽管有研究认为黄韧带肥厚可能和各种炎症因子、生长因子、老龄及机械应力有关,但是导致黄韧带肥厚的关键分子及其调控机制仍然未知。另外,由于缺乏有效的黄韧带肥厚动物模型,尚未发现关于黄韧带肥厚分子机制的体内研究。目的本研究旨在:1.发现黄韧带肥厚的关键调控蛋白,探索其调控细胞外基质形成的机制。2.建立小鼠黄韧
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81672228）；
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背景黄韧带肥厚是腰椎椎管狭窄的一个重要因素,严重时会压迫神经根和马尾,导致腰部疼痛及间歇性跛行。尽管有研究认为黄韧带肥厚可能和各种炎症因子、生长因子、老龄及机械应力有关,但是导致黄韧带肥厚的关键分子及其调控机制仍然未知。另外,由于缺乏有效的黄韧带肥厚动物模型,尚未发现关于黄韧带肥厚分子机制的体内研究。目的本研究旨在:1.发现黄韧带肥厚的关键调控蛋白,探索其调控细胞外基质形成的机制。2.建立小鼠黄韧带肥厚模型,对黄韧带肥厚的分子机制进行体内验证。方法1.收集正常和肥厚的人黄韧带组织,组织学染色检测两组纤维化情况。用同位素相对标记与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术对两组样本进行分析,整合转录组与蛋白质组数据,发现关键蛋白:细胞因子受体样因子1（Cytokine Receptor Like Factor 1,CRLF1）。使用免疫组化和qPCR技术对结果进行验证。2.分离并体外培养人正常黄韧带细胞,使用TGF-β1和成熟的重组人CRLF1刺激黄韧带细胞,通过免疫荧光、Westen Blot及qPCR技术检测各组细胞纤维化相关标志物的mRNA、蛋白表达和ERK1/2信号通路活化情况;加入ERK1/2通路抑制剂,观察其对CRLF1和TGF-β1生物学作用的影响;加入SMAD3通路抑制剂,观察其对TGF-β1诱导的CRLF1的mRNA表达的影响。使用siRNA技术抑制CRLF1表达,观察TGF-β1、IL-1β及机械应力诱导的纤维化是否受到影响。3.建立双足站立小鼠黄韧带肥厚模型,有限元分析黄韧带受力情况,组织学染色观察其病理改变与人的肥厚黄韧带病理改变是否相同。4.构建CRLF1过表达和抑制的腺相关病毒载体,体内验证CRLF1在黄韧带肥厚发展过程中的作用。结果1.肥厚黄韧带组织中有序的弹力纤维明显减少,胶原纤维和肌成纤维细胞明显增加,P-ERK1/2表达量增加,CRLF1在肥厚黄韧带中高表达,且CRLF1阳性细胞数与a-SMA阳性细胞数成正相关,黄韧带内肌成纤维细胞可以分泌CRLF1。2.TGF-β1在转录水平调节纤维化相关标志物mRNA的合成,而CRLF1主要在转录后水平促进这些标志物的合成;CRLF1和TGF-β1均可激活ERK1/2信号通路,阻断ERK1/2通路后CRLF1和TGF-β31的促纤维化作用均被抑制。TGF-β1可以促进CRLF1 mRNA的合成,而CLCF1 mRNA升高不明显,使用SIS3阻断SMAD3通路后,TGF-β1诱导的CRLF1的mRNA表达明显下调。抑制CRLF1可以降低TGF-β1、IL-1β和机械应力导致的纤维化。3.双足站立小鼠黄韧带受力显著增加,双足站姿小鼠黄韧带肥厚模型可以有效模拟人肥厚黄韧带的病理变化。4.双足站立组小鼠黄韧带中CRLF1阳性细胞数明显增加。CRLF1可以在体内促进黄韧带肥厚的形成,抑制CRLF1可以减少黄韧带肥厚的形成。结论CRLF1在多种刺激诱导纤维化的过程中都起到核心节点作用。抑制CRLF1可以减少黄韧带肥厚的形成。
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