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研究背景:黑色素瘤是皮肤癌中一种常见的恶性肿瘤,近年来世界范围内发病率急剧上升,我国每年新发病例约2万例,其预后极差,生存率较低,治疗困难。但是最近几年,针对黑色素瘤的免疫治疗法取得了很大的进展,其中肿瘤免疫治疗成为了一种新型的重要治疗手段。非特异性免疫刺激剂通过参与固有免疫而影响适应性免疫应答,固有免疫应答在适应性免疫应答的起始、调节和适应阶段均起重要作用。被称为病源相关分子模式(PAMP)的微生物、蛋白质、核酸、多糖等小分子外源物进入机体后,会被免疫细胞上的模式识别受体(PRR)识别,进而激发和增强机体的免疫功能,促进免疫系统对肿瘤细胞的杀伤从而消灭肿瘤,发挥抗肿瘤作用。不同的PAMP刺激固有免疫细胞表面的PRR,产生Th1或Th2类不同的细胞因子。这些不同的细胞因子进一步调节特异性免疫细胞的分化,从而影响适应性免疫应答的类型。在肿瘤免疫治疗中,TLR(Toll-like receptors)激动剂作为一类经典的非特异性免疫刺激剂能够强有力地诱发机体免疫应答。在TLR信号介导的免疫反应中树突状细胞(DC)起到了关键作用。骨髓来源的树突状细胞(BMDC)是机体中功能最强的抗原提呈细胞(APC),它在不同时期具有不同的生物活性:未成熟的DC具有较强的迁移和内吞摄取抗原的能力;成熟的DC具有树突状形态,抗原摄取的水平降低,但是加工和提呈抗原的能力升高,能够启动、调控和维持免疫应答,在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。当受到外源TLR激动剂刺激时,DC表面的TLR信号被激活,诱导DC成熟。不同的TLRs与相对应的转接蛋白相互作用,利用My D88依赖和非依赖信号转导方式,并通过NF-κB或MAPK信号转导途径,活化下游的转录因子,进一步上调IL-12、IFN-γ等细胞因子的表达。促使Th0分化为Th1,主导Th1型免疫应答,从而有利于清除肿瘤。实验室前期针对幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白的新型融合蛋白rMBP-NAP潜在的抗肿瘤免疫调节作用的研究表明,rMBP-NAP能够通过调节TLR介导的信号通路发挥显著的抗肿瘤免疫调节作用。基于此,本研究在融合蛋白rMBP-NAP的结构基础上,利用生物信息学分析和基因工程技术手段,从HP-NAP二级结构入手,构建了新的结构片段S1、S2、S3、S4,再将这些得到的片段与rMBP-NAP连接构建成了新的融合蛋白rMBP-NAP-S1、rMBP-NAP-S2、rMBP-NAP-S3和rMBP-NAP-S4。通过qRT-PCR法初步筛选出能够激活BMDC且具有抗肿瘤功能的最优蛋白rMBP-NAP-S1,进一步探讨了rMBP-NAP-S1刺激BMDC活化的作用机制,并评估了rMBP-NAP-S1对小鼠黑色素B16原位瘤模型的治疗效果,为研发新型基于rMBP-NAP相关抗肿瘤免疫调节剂奠定了理论和实验基础。研究目的:基于前期课题对rMBP-NAP抗肿瘤免疫调节作用的研究,我们对其蛋白结构进行了进一步探索,并构建表达了一系列以rMBP-NAP为结构基础的新的融合蛋白rMBP-NAP-S,通过BMDC筛选出最佳候选蛋白,利用小鼠黑色素B16原位瘤模型进一步检验其抗肿瘤免疫调节作用,以期能够深入研究其发挥作用的有效结构功能片段,阐明rMBP-NAP-S的抗肿瘤免疫调节作用和机制。研究方法:1、PCR技术扩增rMBP-NAP基因,通过重叠延伸得到融合基因NAP-S1、NAP-S2、NAP-S3和NAP-S4,利用基因工程技术成功构建重组质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3和pMal-c2X-NAP-S4。IPTG诱导表达并亲和层析纯化得到融合蛋白rMBP-NAP-S1、rMBP-NAP-S2、rMBP-NAP-S3和rMBP-NAP-S4。SDS-PAGE蛋白胶鉴定蛋白诱导形式、表达形式和纯化结果。2、流式细胞术检测采用小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)联合白细胞介素(rm IL-4)诱导的BMDC纯度。3、荧光定量PCR(qRT-PCR)检测融合蛋白rMBP-NAP-S1、rMBP-NAP-S2、rMBP-NAP-S3、rMBP-NAP-S4刺激BMDC 2 h、16 h后细胞因子IL-12p40、IFN-γ、NF-κB的相对表达量;qRT-PCR检测不同浓度的融合蛋白rMBP-NAP-S1刺激BMDC后细胞因子(IL-12p40、IFN-γ、NF-κB)和细胞表面标志物(CD80、CD86、MHCⅡ)的相对表达量。4、流式细胞术检测融合蛋白rMBP-NAP-S1刺激BMDC后细胞表面标志物(CD80、CD86、MHCⅡ)的表达;qRT-PCR检测融合蛋白rMBP-NAP-S1刺激BMDC后TLR(TLR2、TLR4)的相对表达量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测融合蛋白rMBP-NAP-S1刺激BMDC后上清中细胞因子(IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α)蛋白水平的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测融合蛋白rMBP-NAP-S1刺激BMDC后信号通路中相关蛋白(TLR2、TLR4、My D88、NF-κB)的表达情况。5、建立了小鼠黑色素B16原位瘤模型,评估融合蛋白rMBP-NAP-S1对此模型的抗肿瘤免疫效果,统计在整个实验过程中肿瘤体积、重量变化,绘制肿瘤生长曲线。研究结果:1、成功构建原核表达载体pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3和pMal-c2X-NAP-S4。IPTG诱导表达,亲和层析纯化得到了融合蛋白rMBP-NAP-S1、rMBP-NAP-S2、rMBP-NAP-S3和rMBP-NAP-S4。2、流式细胞术检测BMDC纯度达到80%以上,细胞纯度较高且状态良好,可用于后续试验。3、qRT-PCR结果显示融合蛋白rMBP-NAP-S1(200μg/m L)刺激BMDC 16 h后IL-12p40、IFN-γ、NF-κB、CD80、CD86、MHCⅡ的相对表达量均有升高。初步筛选出融合蛋白rMBP-NAP-S1作为最佳候选蛋白。4、流式细胞术分析BMDC经过融合蛋白rMBP-NAP-S1(200μg/m L)刺激16h后细胞表面标志物CD80、CD86、MHCⅡ的表达水平显著升高;qRT-PCR结果显示TLR2、TLR4的m RNA表达水平均有升高;ELISA结果表明其促进了TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12蛋白水平的表达;Western blot实验表明rMBP-NAP-S1通过My D88信号通路进行信号转导,其中TLR4蛋白水平变化不大,TLR2、My D88、NF-κB蛋白表达水平显著上升。5、对小鼠黑色素B16原位瘤模型的蛋白给药治疗结果显示融合蛋白rMBP-NAP-S1对黑色素瘤的生长具有一定的抑制作用。研究结论:本研究成功构建得到重组质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3和pMal-c2X-NAP-S4,并且诱导表达纯化出融合蛋白rMBP-NAP-S1、rMBP-NAP-S2、rMBP-NAP-S3和rMBP-NAP-S4。筛选出融合蛋白rMBP-NAP-S1在浓度为200μg/m L,刺激BMDC时间为16 h时,可作为肿瘤免疫治疗的最佳候选蛋白。rMBP-NAP-S1刺激BMDC发挥作用主要是通过TLR2-My D88-NF-κB信号通路调节细胞因子的表达,从而发挥免疫调节功能。利用小鼠黑色素B16原位瘤模型验证了融合蛋白rMBP-NAP-S1能够抑制黑色素瘤生长。