背景肿瘤细胞的无限增殖和转移是肿瘤发生的根本,临床上肿瘤常以全身性的破坏形式出现,表现为一系列的症状。全球每年新发的癌症病例有900万例之多,其中30%~50%的癌症患者经历各种形式的疼痛,特别是晚期癌症患者伴有疼痛比例可高达75%~90%。在肿瘤引起的各种形式的疼痛中,转移性骨癌痛是最常见的类型之一,严重影响患者的生活,造成重大心理负担。目前骨癌痛的发生机制我们理解的还不是太充分,骨癌痛治疗方面也不尽如人意。世界卫生组织指南指出骨癌痛的治疗按阶梯治疗从非阿片类药到强阿片类药,同时给予辅助性的治疗如双磷酸盐、局部放射治疗等。基于此,有必要对骨癌痛的机制做进一步研究,目前大家公认的与骨癌痛的发生机制包括:兴奋性的突触的产生、神经胶质细胞的激活和促炎介质的高表达。其中促炎介质中的趋化因子在骨癌痛发展中的作用目前引起了极大的关注。作为细胞因子中的具有趋化作用的一类小分子,有50多个家庭成员,主要介导外周免疫系统细胞的迁徙。近来越来越多的证据证实趋化因子不单单表达于外周神经系统,还表达在中枢神经系统,参与中枢神经系统生理性和病理性的调节。根据趋化因子家族中四个保守半胱氨酸残基的顺序将其分为4类。原则上,趋化因子和其同来源的受体相结合来发挥作用,结合后激活细胞内的信号传导通路。目前为止,发现的和骨癌痛相关的趋化因子及其受体包括ccl2/ccr2、cx3cl1/cx3cr1、ccl5/ccr5、cxcl12/cxcr4、cxcl10/cxcr3和cxcl1/cxcr2。吗啡是μ阿片受体激动剂,通过阿片受体发挥镇痛作用,是目前临床常用的治疗骨癌痛的药物。前期基因芯片研究结果示骨癌痛大鼠中趋化因子cxcl13基因的高表达。近期在脊神经结扎造成的神经病理性痛模型实验中发现脊髓中趋化因子基因上调,尤其是最初来源于b淋巴细胞淋巴结细胞基质的cxcl13,其基因上调幅度最大。无论是在中枢还是在外周疼痛信号通路中,趋化因子和吗啡在机体免疫、炎症性成、神经元的特定的反应中都发挥了重要的作用。目前发现的参与了吗啡镇痛的调节的细胞因子包括cx3cl1、cxcl12、cxcl10、ccl2、ccl3和ccl5等。然而,在骨癌痛大鼠中,趋化因子cxcl13和吗啡镇痛之间的作用还没有明确的研究。目的探究在正常大鼠和骨癌痛大鼠中趋化因子cxcl13对吗啡镇痛作用的影响,从而为骨癌痛的治疗提供新的依据。方法1.walker256乳腺癌细胞的制备购自华中科技大学研究室的walker256乳腺癌细胞腹腔注射入重160~180g的清洁级sd雌性大鼠。注射后每天观察种植癌细胞的大鼠腹部变化,待5~7天形成腹水后抽取。将抽取的腹水用d-hanks液漂洗离心至少3次,离心转数600r/min,每次离心5min。所得癌细胞放于冰块上备用。2.实验动物清洁级的sd雌性大鼠购自郑州大学动物实验中心,重约180~220g。喂养环境室温在24±0.5°c,昼夜各12小时,自由饮食。3.动物实验分组骨癌痛模型建立:雌性清洁级sd大鼠24只,重约180~220g,随机分为3组分别为正常组、假手术组、骨癌痛组。分别测定3组建模后0、1、3、5、7、10、14、21天大鼠的机械缩足阈值。cxcl13蛋白的表达:雌性清洁级sd大鼠24只,重约180~220g,随机分为2组分别为假手术组和骨癌痛组,用免疫印迹技术测定大鼠0、7、14、21天时大鼠cxcl13蛋白的表达水平。cxcl13对正常大鼠的作用:雌性清洁级sd大鼠24只,重约180~220g,随机分为4组,分别为盐水组、吗啡组、cxcl13重组蛋白组、cxcl13重组蛋白+吗啡组,鞘内给药后,分别测定给药前、给药后15min、30min、60min、90min和120min时大鼠机械缩足阈值的变化情况。cxcl13在骨癌痛大鼠中对吗啡镇痛作用的影响:同正常大鼠。4.试验药物及其给药方式μ阿片药物受体激动剂,吗啡购自中国东北制药集团公司。大鼠cxcl13重组蛋白购自美国的派普泰克公司。所有的药物均是鞘内给药,将pe-10管置入脊髓蛛网膜下腰膨大部位,给药体积为10ul。5.骨癌痛模型的制备根据既往骨癌痛模型的建立的报道,大鼠骨癌痛模型的建立采用购自华中科技大学研究室的walker乳腺癌细胞(10ul4x106细胞/毫升)种植在大鼠近胫骨段的骨髓腔里。6.鞘内置管与骨癌痛大鼠模型麻醉方式相同,按既往报道将pe-10导管置于大鼠的蛛网膜下腔腰膨大的位置。7.行为学测试将大鼠放于带有金属丝网格的玻璃笼子里,测试前放置金属丝网中30min。用vonfrey细丝测试所有大鼠的足趾的机械缩足阈值(mwt)。每次测试持续5s,每只大鼠重复测试5次,每次间隔10min。8.免疫印迹实验用蛋白免疫印迹的发法检测骨癌痛大鼠和正常组大鼠在0、7、14、21天时cxcl13蛋白和其受体cxcr5的表达。结果1.与正常组和sham组相比,骨癌痛组在1、3、5、7、10、14、21天时差异具有统计学意义。正常组和sham组相比,各个时间点的mwt值均无统计学意义(p>0.05)。骨癌痛大鼠中各个时间点中与第0天相比第3、5、7、10、14、21时MWT值差异均具有统计学意义(P<0.05),特别是14天时,MWT的值最低,说明骨癌痛模型建立成功。2.用蛋白免疫印迹实验检测骨癌痛组和假手术组中CXCL13蛋白和其受体CXCR5的表达水平。与sham组相比,骨癌痛大鼠在建模后7、14、21天中的CXCL13和CXCR5的表达量增加,差别均具有统计学意义(P<0.05)。建模后14天时CXCL13和CXCR5蛋白的表达量最多,与骨癌痛大鼠MWT值相一致,说明骨癌痛大鼠中CXCL13的表达增加使大鼠的MWT值降低。3.正常大鼠中,与盐水组相比,吗啡组大鼠的MWT值明显上升(P<0.05),CXCL13重组蛋白组大鼠的MWT值明显下降(P<0.05)。与吗啡组相比,CXCL13重组蛋白+吗啡组的MWT值下降(P<0.05)。说明CXCL13对正常大鼠具有致痛作用并且减弱吗啡的镇痛作用。4.骨癌痛大鼠中,与盐水组相比,CXCL13重组蛋白组在60min时MWT值差异具有统计学意义(P<0.05),吗啡组MWT值各个时间点均具有统计学意义(P<0.05)且MWT值均升高。与单纯吗啡组相比,CXCL13重组蛋白+吗啡混合物组的MWT值在30min、60min时差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步说明在骨癌痛大鼠中CXCL13对吗啡的镇痛具有负性调节作用。结论趋化因子CXCL13具有致痛作用,在骨癌痛大鼠中其表达的上调减弱吗啡的镇痛作用。