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目的通过比较类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者与正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow- derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖能力及向软骨分化的能力,探讨RA患者BMSCs是否存在缺陷或变异,能否用于自体移植,抑或RA本身就是一种干细胞病,与RA的发病相关。方法1. BMSCs的分离、培养及鉴定:实验分为RA患者组与正常对照组,分别采集8例RA患者与8例健康志愿者骨髓各5ml,用密度梯度离心及贴壁法对细胞进行分离、培养、传代,流式细胞术鉴定P3代BMSCs的表面标志。2. BMSCs的增殖能力测定: MTT法测定P3、P6代BMSCs生长曲线,计算细胞群体倍增时间;流式细胞术测定细胞周期,计算增殖指数;实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)测定端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的表达。3. BMSCs在体外软骨诱导培养液中向软骨细胞分化:将P3代BMSCs置于含10ng/ml的rhTGF-β1,丙酮酸钠1mmol/L,地塞米松10-7mol/L,牛胰岛素6.25μg/ml,Vc 0.5ul/ml,5%胎牛血清软骨细胞诱导培养液中培养,7天、14天时在倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态,14天时用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的分泌,免疫组化法检测Ⅱ型胶原的分泌,以L-DMEM完全培养液中培养的正常人BMSCs为阴性对照。结果1.正常对照组BMSCs在P3代时细胞形态均一,长梭形或多角形,呈平行、旋涡状、辐射状排列。经流式细胞仪检测,CD34、CD45阴性,CD44、CD71阳性,证明获得细胞为间充质干细胞。RA患者BMSCs在形态学上与正常对照组无明显差异。2. BMSCs增殖能力测定:2.1正常对照组P3代时细胞群体倍增时间为4.73±0.31天,RA组为4.80±0.33天,两组差异无统计学意义,P>0.05;P6代时正常对照组细胞群体倍增时间为5.74±0.35天,RA组为6.33±0.34天,RA组BMSCs群体倍增时间长于对照组,差异具有统计学意义,P<0.001。2.2正常对照组P3代BMSCs增殖指数为17.87±2.05%,RA组为16.86±2.09%,两组差异无统计学意义,P>0.05;P6代正常对照组BMSCs增殖指数为10.73±1.78%,RA组为6.17±2.17%,RA组增殖指数小于对照组,差异具有统计学意义,P<0.01。2.3正常对照组P6代MSCs hTERT表达量为10.63±1.49,RA组为3.08±1.01,RA患者hTERT表达水平较正常对照组低,差异具有统计学意义,P<0.01。3.正常对照组MSCs在软骨细胞诱导培养液中培养14天后甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化均为阳性,证实BMSCs成功诱导为类软骨细胞。同样RA组亦可诱导为类软骨细胞。结论1.两组人群均可成功分离、培养得到BMSCs,且RA患者与正常对照组细胞形态无明显差异。2.两组人群P3代BMSCs细胞增殖能力的差异无统计学意义,但在P6代时RA患者BMSCs的增殖滞后于正常组,推断RA患者BMSCs较正常人衰老速度加快;hTERT测定显示RA组BMSCs的hTERT表达量低于正常对照组,说明这种提前老化可能与hTERT的表达过低有关,hTERT表达减少后不能维持端粒长度,细胞寿命缩短,提前进入衰老、凋亡。3.两组BMSCs均可在体外诱导培养液中向软骨细胞进行分化。4.由此推测,RA是一种干细胞病,在BMSCs水平就存在缺陷,而将外源性hTERT导入RA患者BMSCs是自体BMSCs移植治疗RA的一条出路。另外,异体BMSCs移植仍然是治疗难治性RA的一个选择。