家蚕（Bombyx mori）是从野桑蚕（Bombyx mandarina）进化而来,在长期的人工选择过程中,家蚕的体重、茧层率等经济性状受到强烈的正向选择,因此需要更多的物质和能量供给以满足生长发育的需要。除中肠外,涎腺是大多数昆虫另一个与营养利用相关的重要器官。涎腺在动物营养利用方面发挥着多种不同的作用。已有的部分数据显示,在取食时涎液可以润滑食物有利吞咽;涎液中含有消化酶可对食物进行初步消化。然而,关于家蚕涎腺功能的深入研究报道非常缺乏。为了探究家蚕驯化之后有关营养消化相关的差异,本课题选择了营养利用相关器官涎腺作为研究对象。本研究以鳞翅目昆虫家蚕和野桑蚕为研究对象,在涎腺组织中筛选获得一个在野桑蚕高量表达,而在家蚕中表达量极低的基因脂肪酸脱氢酶5（Bmdesat5）,对其酶活功能及其酶促产物对营养利用及生长发育等性状的影响进行了初步研究。获得了以下研究结果:1.Bmdesat5的序列分析、抗体制备、表达特征及亚细胞定位对15个脂肪酸脱氢酶基因在家蚕和野桑蚕涎腺的转录水平进行q RT-PCR分析,结果表明6个基因在野桑蚕中显著高于家蚕,Bmdesat5的表达差异尤为显著。通过Western Bloting对Bmdesat5的表达差异进行确证,结果显示其蛋白水平在野桑蚕中高丰度表达,而在家蚕不表达。分别从家蚕和野桑蚕中克隆获得Bmdesat5基因ORF序列,序列比对分析发现二者ORF序列相同。蛋白多序列比对发现,Bmdesat5蛋白具有保守的4个疏水结构域和3个富含组氨酸基序的活性中心;进化树聚类分析显示,Bmdesat5与Δ11脂肪酸脱氢酶聚为一支。亚细胞定位实验结果表明,Bmdesat5蛋白定位于细胞内质网上。为了获得Bmdesat5蛋白的特异性抗体,截取了Bmdesat5蛋白羧基端105氨基酸在大肠杆菌中异源表达,对表达的包涵体蛋白进行纯化,制备了兔多克隆抗体。2.基于GC/MS的家蚕与野桑蚕涎腺脂肪酸组成及差异脂肪酸鉴定为了探究家蚕和野桑蚕涎腺中Bmdesat5的差异表达对涎腺脂肪酸成分的影响,基于GC/MS实验平台测定了家蚕和野桑蚕涎腺脂肪酸成分和含量,并对差异脂肪酸进行鉴定。结果表明,家蚕（D9L）涎腺中鉴定到18种脂肪酸,野桑蚕（云南）涎腺中鉴定到21种脂肪酸。有9种脂肪酸在家蚕高于野桑蚕,13种脂肪酸在野桑蚕高于家蚕。从脂肪酸饱和度分析显示,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸成分在野桑蚕高于家蚕,多不饱和脂肪酸在家蚕高于野桑蚕。3.酿酒酵母异源表达Bmdesat5及酶促产物检测为了探究Bmdesat5的催化合成产物,利用酿酒酵母真核表达系统对Bmdesat5进行了异源表达,并通过GC/MS测定了阳性重组工程菌株中脂肪酸成分和含量。实验结果表明,Bmdesat5蛋白在酿酒酵母中成功诱导表达,在阳性重组工程菌株中检测到两个产物,即产物1:顺式异棕榈油酸,前体物质为十六烷酸;产物2:顺式异油酸,前体物质为十八烷酸。有趣的是,顺式异油酸在野桑蚕涎腺中的含量明显高于家蚕,初步说明Bmdesat5在野桑蚕唾液腺的特异高丰度表达是导致顺式异油酸含量高的原因。4.家蚕添食Bmdesat5酶促产物对家蚕营养利用、生长及发育等性状的影响为了探究顺式异油酸对家蚕营养利用的影响,对五龄期家蚕进行脂肪酸添食实验,按照每天每克体重添食0.5μg脂肪酸进行。添食顺式异油酸的家蚕与添食油酸组相比,五龄3天的食下量雄性下调16.8%、雌性下调13.5%。五龄3天家蚕体重统计发现添食顺式异油酸相对于添食油酸组雄性家蚕与雌性家蚕体重分别下降20.3%和16.1%。蛹5天时统计经济性状发现,添食顺式异油酸组与添食油酸组比较,雄性全茧重、蛹重、茧层重分别下调13.2%、13.2%、13.1%;雌性全茧重、蛹重、茧层重分别下调9.7%、10.0%、8.4%。不管是雄性还是雌性的茧层率变化没有显著差异。通过添食实验表明,食物中异油酸含量增加会导致家蚕取食量的下降,并进而影响家蚕的生长与丝蛋白的合成。本课题鉴定获得一个在野桑蚕涎腺高丰度表达,而在家蚕涎腺不表达的脂肪酸脱氢酶Bmdesat5。对Bmdesat5进行了生物信息学分析表明该基因具有膜结合类脂肪酸脱氢酶的结构特征,进化树表明可能为Δ11脂肪酸脱氢酶。通过酿酒酵母真核系统异源表达,发现了Bmdesat5的主要酶促产物为顺式异棕榈油酸和顺式异油酸。而顺式异油酸在野桑蚕涎腺中的含量也显著高于家蚕,这初步证明Bmdesat5在野桑蚕的高丰度表达导致了顺式异油酸在野桑蚕涎腺中的高含量。通过对家蚕的添食顺式异油酸,证明其具有抑制家蚕取食量,进而影响家蚕体重的效果。综合以上研究结果,初步推测:家蚕在驯化选择过程中,通过抑制其涎腺Bmdesat5的表达,进而减少涎腺中调控摄食量的顺式异油酸的合成,使其对桑叶的取食量显著增多,从而为个体的生长发育提供了充足的能量及物质基础。