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春石斛(nobile-type Dendrobium)花色丰富艳丽、花姿优美、花期长,极具观赏价值,是重要的商品盆花。但目前在我国市场春石斛无论质量和产量与国外都有较大差距。原因之一就是缺乏优良品种。目前国内春石斛新品种选育主要是待栽培3～4年开花后进行,周期长,优良品种不仅少,且以扦插为主的繁殖方法,繁殖系数低,远不能满足商业生产的需求。此外,由于栽培条件、市场需求及生产技术等诸多不利因素的影响,又缺乏保存技术,企业投入高成本从国外大量引进的优良品种,尚未进行规模化生产就已消失,优良种质流失严重。因此,为进一步推动国内春石斛市场化生产,系统地开展春石斛优良品种快速筛选、种苗扩繁及优良种质保存研究有重要意义。本研究以春石斛为试材,在课题组前期研究的基础上,开展了春石斛优良品种早期筛选指标体系优化、组织培养快速繁殖研究,在此基础上对玻璃化超低温保存技术及其相关机理进行了探讨。主要研究结果如下:(1)明确了成花品质是评价春石斛品种优劣的关键指标。单株型(仅1个开花枝)春石斛品种的一年生休止叶期扦插苗的株高、节长及茎尖腐胺(Put)含量与其三年生植株成花品质显著相关,可作为其优良品种早期筛选的指标;丛生型(多个开花枝)春石斛品种的一年生休止叶期扦插苗的节数、叶数、株高、根数、根粗及茎尖Put含量与其成花品质显著相关,可作为其优良品种早期筛选的指标。建立了2种类型春石斛的优良品种早期快速筛选技术。(2)建立了优良品种’森禾2006’的拟原球茎(PLBs)途径和丛生芽途径2种途径的组培快繁技术体系,增殖倍数可达5.1,移栽成活率可达90%以上。PLBs途径,适宜诱导培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1 TDZ+2.0 g·L-1酸水解酪蛋白,增殖培养基为1/2MS+2.0 g·L-1酸水解酪蛋白,分化培养基为1/2MS+1.0 mg L-1 Kin+0.1 mg.L-1 NAA;不定芽诱导及增殖适宜培养基为1/2MS+0.1 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 Kin+0.2 mg·L-1 NAA;适宜壮苗生根的培养基为 MS+0.5 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 NAA+100.0 g·L-1香蕉泥(BP)。培养条件为光照时间14 h·d-1,光照强度40 μmol·m-2·s-1,培养温度23±2℃。品种’森禾2002’同样适用。(3)初步建立了 ’森禾2006’茎尖及PLBs玻璃化超低温保存技术程序:在超净工作台双目解剖镜下,切取长2～3 mm的茎尖(或3 mm的PLBs),转至含有0.3 M蔗糖的MS培养基中,4℃条件下,预培养1d(或2d);将预培养后的茎尖转移至装有loading溶液的200 μL离心管中,25℃下装载60 min(或40 min),中间更换1次loading溶液;吸去loading溶液,用预冷过的PVS2溶液,0℃下脱水40 min,更换新鲜PVS2溶液后,封口膜封口,迅速投入液氮冻存;需要扩繁时,将材料从液氮中取出,37℃水浴化冻60 s,常温下去装载20 min,中间更换1次unloading溶液,后进行恢复培养。冻后茎尖及PLBs的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色成活率分别为79.2%和85.0%,但未能实现再生。(4)’森禾2006’茎尖及PLBs玻璃化超低温保存过程中存活率下降的机理研究显示,玻璃化超低温保存不同处理步骤对其存活率影响不同,茎尖存活率的下降主要发生在预培养、装载及解冻后,PLBs存活率的显著下降发生在预培养、装载、PVS2脱水及解冻处理后;活性氧(ROS)水平、抗氧化物质含量及氧化产物含量等研究结果显示,春石斛茎尖及PLBs超低温保存过程中的存活率降低与ROS引起的氧化应激造成的氧化损伤密切相关,但不同材料在超低温保存的不同阶段,引起氧化应激的主要ROS种类不同。(5)在导致’森禾2006’茎尖及PLBs玻璃化超低温保存存活率显著下降的关键步骤导入系列浓度的4种外源蛋白CAT、MDH、HSP70及PDH,研究对冻后存活率的影响。结果表明CAT、MDH及HSP70 3种与抗氧化应激相关的蛋白对茎尖及PLBs冻后存活率的提高均起积极作用,茎尖及PLBs冻后存活率较对照最高可分别提高15.3%和18.9%,但适宜添加阶段及添加浓度因保存材料而异;而外源PDH对提升液氮冻后存活率无效。综上所述,本研究优化了春石斛优良品种早期筛选指标体系,缩短品种筛选时间2年,提高了筛选效率;建立了组织培养快繁体系,为优良品种大量繁殖提供了技术支撑;玻璃化超低温保存损伤机制研究表明,氧化应激是导致茎尖和PLBs超低温保存损伤的重要因子,添加相关外源抗ROS蛋白是提高其超低温保存后存活率的可行途径之一。