临床研究显示，肾细胞肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肝脏肿瘤等肿瘤患者经常会出现深静脉血栓、弥散性血管内凝血、肺栓塞、游走性浅表血栓性静脉炎、门静脉血栓和动脉血栓栓塞等血栓栓塞性疾病。临床上将肿瘤相关的血栓称为Trousseau综合症。肿瘤发生与血栓形成的关系极为密切，血栓的形成在肿瘤转移、肿瘤血管生成等机制中起着重要作用，而血栓又会加大癌症的发病率和死亡率。金葡球菌肠毒素C2（staphylococcal enterotoxins, SEC2）是由金黄色葡萄球菌产生的一类超抗原，可直接与抗原递呈细胞上的MHCII类分子和T细胞受体Vβ区结合，极低浓度下即可刺激大部分T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生强烈的免疫应答反应和显著的肿瘤抑制作用，临床上应用于肺癌、直肠癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤的治疗。葡激酶（staphylokinase, Sak）是典型的第三代溶栓药物代表，与传统溶栓药物相比，葡激酶具有纤维酶原激活能力强的特点，并且免疫原性低，特异性高、过敏反应少，是目前相对较可靠和安全的心血管疾病治疗药物。基于SEC2的广谱抗肿瘤活性和Sak的高效溶栓作用，本实验室前期构建了嵌合蛋白SEC2-linker-Sak和Sak-linker-SEC2，以纤维平板法确定嵌合蛋白具有与Sak相似的体外溶栓活力，经MTT法确定嵌合蛋白保留了SEC2的体外淋巴细胞增殖活力和抑制宫颈癌Hela细胞株的活性。然而，但肠毒素作为潜在的胃肠毒素，可引起食物中毒伴呕吐，引发腹绞痛和严重腹泻，并且分子量过大（由239个氨基酸组成，分子量约为27.6kDa），不易于静脉注射和人体吸收，进入体内易引起过敏反应和毒副作用，从而限制了SEC2在临床上的应用。本实验室前期研究通过截去SEC2N端17个氨基酸和C端132个氨基酸获得无毒副作用并保留超抗原活性的肠毒素突变体蛋白。此外，本实验室还利用现代分子生物学技术，缺失N端10个氨基酸，获得了溶栓活性不变的葡激酶突变体蛋白。在前期研究基础上，本研究利用基因工程技术，制备分子量较低的嵌合蛋白。经镍亲和层析柱纯化蛋白，利用纤维平板法确定其溶栓活性，MTT法确定其抗肿瘤活性。研究结果如下：1）表达载体构建：构建载体pET28a-Δsec2-linker-Δsak，将得到的载体pET28a-Δsec2-linker-Δsak经PCR去除Δsec2和Δsak之间的linker，末端磷酸化、平末端连接，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经酶切和测序确认得到表达载体pET28a-Δsec2-Δsak。同样的方法构建pET28a-Δsak-linker-Δsec2。2）嵌合蛋白诱导表达和纯化：将重组大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB培养液中摇瓶培养，当菌液吸光值达到0.6时，30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时后收集菌体细胞。用超声波破碎菌体细胞，10000rpm离心20min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白His-ΔSEC2-ΔSak和His-ΔSak-ΔSEC2。His-ΔSEC2-ΔSak嵌合蛋白和His-ΔSak-ΔSEC2经过肠激酶切割除去N端组氨酸标签，再次过Ni-NTA亲和层析柱，得到嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2和ΔSEC2-ΔSak。3）嵌合蛋白的western blot鉴定：以纯化的SEC2作为抗原通过常规方法免疫家兔，获得了特异性较强的针对SEC2的抗体，通过间接Elisa方法测出抗体效价为102400。经western blot鉴定证明嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2能够和SEC2抗体能特异性结合。4）生物学活性分析：以纤维平板法分析嵌合蛋白体外溶栓活性，以MTT法分析嵌合蛋白的体外促淋巴细胞增殖活性和抑瘤活性。结果表明，所得到嵌合蛋白既具有与Sak相似的体外溶栓活力，又保留了SEC2的体外促淋巴细胞增殖活力和抑制胃癌823细胞株的活性。综上所述，本研究所构建嵌合蛋白具有肠毒素C2的超抗原活性，可有效抗肿瘤，并且去除与SEC2催吐活性相关及与超抗原活性无关的氨基酸残基，避免了其毒负作用，大大降低了分子量。同时，嵌合蛋白的溶栓机制和作用效果与葡激酶相似，即通过激活人体溶栓系统溶解血栓。本研究将为临床上研制新型Trousseau综合症治疗药物奠定良好的基础。