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目的尿蛋白不仅是临床诊断肾脏疾病的标志,其也能加重肾损伤。白蛋白作为尿蛋白中最主要的成分,已经被证明能够引起肾小管细胞凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激等。前期研究已经证实活性氧(ROS)介导了尿蛋白超负荷诱导的肾小管上皮细胞自噬激活,并且自噬减轻了细胞损伤。但是尿白蛋白诱导肾小管上皮细胞自噬并减轻细胞损伤的具体机制尚不清楚。有研究表明,线粒体是真核细胞内调控能量代谢的场所,多种刺激能够引起线粒体损伤,释放ROS增多,ROS能够通过多种机制诱导自噬激活,自噬激活后进一步清除受损的线粒体和过多的ROS从而促进细胞存活。因此,我们推测线粒体来源的ROS可能介导了白蛋白超负荷所致肾小管上皮细胞损伤中自噬,并且自噬通过清除受损线粒体、减少ROS来减轻细胞损伤。本研究通过建立白蛋白超负荷模型,应用多种分子生物学技术,从体外水平观察白蛋白处理、抗氧化干预、线粒体功能干预以及自噬干预后肾小管上皮细胞自噬强度、ROS水平、线粒体功能、细胞损伤程度的变化,探讨线粒体来源的ROS介导自噬激活在白蛋白超负荷致肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法(1)尿白蛋白超负荷模型的建立:白蛋白组(ALB组)运用浓度为8mg/ml的人血清白蛋白处理体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)8h。(2)抗氧化干预对白蛋白所诱导的HK-2细胞自噬的影响分组:设正常对照组(Control)、白蛋白组(ALB)、ALB+NAC组、NAC组;干预线粒体功能对白蛋白所诱导的HK-2细胞ROS、自噬的影响分组:设正常对照组(Control)、白蛋白组(ALB)、ALB+CCCP组、ALB+ALC组;干预自噬对白蛋白处理的HK-2细胞线粒体损伤、ROS、细胞凋亡和细胞活力的影响分组:设正常对照组(Control)、白蛋白组(ALB)、ALB+RAP组、ALB+CQ组。(3)检测指标:通过免疫荧光和免疫印迹技术检测各组HK-2细胞LC3、p62及细胞质cytochrome-c的表达,通过DCF免疫荧光技术检测各组HK-2细胞ROS的水平,JC-1试剂盒染色技术检测各组HK-2细胞线粒体膜电位的变化。TUNEL法检测各组HK-2细胞凋亡率,MTT检测各组HK-2细胞生长活力。结果(1)白蛋白对HK-2细胞自噬、ROS水平及线粒体功能的影响:免疫荧光及免疫印迹结果示,白蛋白刺激后HK-2细胞的LC3表达明显比对照组增多,p62表达比对照组显著地下调,差异具有统计学意义(P<0.05);DCF免疫荧光结果示,ALB组细胞ROS表达多于对照组(P<0.05);JC-1染色显示,与对照组相比,ALB组细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05);免疫印迹检测显示,ALB组细胞质cytochrome-c蛋白水平较对照组明显增多(P<0.05)。(2)抗氧化干预对白蛋白所诱导的HK-2细胞自噬的影响:免疫印迹结果显示,与ALB组相比,ALB+NAC组LC3蛋白表达下调(P<0.05),而NAC组LC3-II蛋白水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)干预线粒体功能对白蛋白所诱导的HK-2细胞ROS、自噬的影响:DCF免疫荧光检测显示,与ALB组相比,ALB+CCCP组HK-2细胞ROS表达增多,ALB+ALC组HK-2细胞ROS水平下降(P<0.05);免疫印迹结果显示,ALB+CCCP组LC3、细胞质cytochrome-c蛋白水平较ALB组进一步增多,p62水平较ALB组进一步减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而ALB+ALC组LC3、细胞质cytochrome-c蛋白水平低于ALB组,p62水平高于ALB组(P<0.05)。(4)干预自噬对白蛋白处理的HK-2细胞线粒体损伤、ROS、细胞凋亡和细胞活力的影响:免疫印迹结果显示,ALB+RAP组细胞质cytochrome-c水平较ALB组进一步减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而ALB+CQ组细胞质cytochrome-c水平明显高于ALB组(P<0.05);JC-1染色免疫荧光显示,ALB+RAP组细胞线粒体膜电位明显高于ALB组(P<0.05),ALB+CQ组细胞线粒体膜电位显著低于ALB组(P<0.05);DCF免疫荧光示,与ALB组相比,ALB+RAP组HK-2细胞ROS水平减少,而ALB+CQ组HK-2细胞ROS进一步增多(P<0.05)。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒与MTT检测结果显示,白蛋白处理后HK-2细胞凋亡率增加,细胞活力降低(P<0.05),ALB+RAP组细胞凋亡率较ALB组明显减少,细胞活力增高,而ALB+CQ组细胞凋亡率较ALB组进一步增高,细胞活力降低(P<0.05)。结论本研究证明:(1)白蛋白处理后HK-2细胞自噬激活伴随着ROS产生增多及线粒体损伤;(2)抗氧化干预可减轻白蛋白诱导自噬表达;(3)抑制线粒体功能可以进一步促进白蛋白诱导的HK-2细胞ROS的释放与自噬,而稳定线粒体则抑制白蛋白诱导的HK-2细胞ROS产生与自噬;(4)促进自噬能够减轻HK-2细胞线粒体损伤,降低ROS水平,减少细胞凋亡,提高细胞活力,而抑制自噬则加重线粒体损伤,促进ROS释放,加重细胞凋亡,降低细胞活力。综上所述,损伤线粒体来源的ROS介导了白蛋白超负荷诱导的肾小管上皮细胞自噬激活,而且自噬通过清除受损的线粒体,减少ROS释放进而减轻肾小管上皮细胞损伤。