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前言：人类WNK4(Human With No lysine[K]kinase4,hWNK4)基因编码一种特殊类型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为WNK激酶(With No lysine[K]kinase,WNK)家族成员之一。由于该激酶家族成员在激酶结构域缺乏其它激酶高度保守的赖氨酸而得名。该赖氨酸在其它激酶参与锚定ATP的α和β磷酸基团和随后的激酶磷酸化作用,但WNK激酶的赖氨酸被半胱氨酸所替代后激酶的生物活性并没有发生改变。hWNK4基因定位于17q21.31,基因组全长约16kb,含有19个外显子,cDNA全长为3861bp,编码1231个氨基酸。hWNK4基因的错义突变可导致一种遗传性高血压——Ⅱ型假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM,No.145260),其主要临床表现为高血压和高血钾。研究表明WNK4激酶主要表达在肾脏,通过调节肾脏远曲小管和集合管上的多种离子转运体和离子通道(如:Na-Cl共转运体[NaCl cotransporter,NCCT],肾外髓钾离子通道[Renal OuterMedullary K+ Channel,ROMK],上皮钠通道[Epithelial Sodium Channel,ENaC]等)参与机体水盐代谢和血压调节。目前关于hWNK4基因的研究主要集中在功能方面,而hWNK4基因表达调控机制以及上游调控因子仍不十分清楚。
糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)在人体内主要由肾上腺分泌,是一种重要的生理调节因子,它通过调节各种类型细胞内的基因表达行使其功能,在物质代谢、水盐平衡调节、细胞增殖和分化方面发挥重要作用。在临床,GC是最常用药物之一,但长期使用易引起水盐代谢紊乱,导致高血压。所以本研究拟通过分析GC对hWNK4基因表达的影响和作用机制来鉴定hWNK4基因是否是GC引起水盐代谢紊乱的一个作用靶点。
真核生物基因的近端启动子区(-250～+250)通常含有调节基因转录的重要顺式作用元件。生物信息学分析显示hWNK4基因近端启动子区无典型的TATA盒,但富含GC序列和一些潜在的转录因子作用元件,如Sp1、AP-1和C/EBP等。前期研究中,我们发现hWNK4基因近端启动子区一个关键的正性调控区,因此本研究拟解析该正性调控区中所含的顺式作用元件,从而进一步揭示hWNK4基因转录调控机制。
材料与方法：
一、实验材料
1、人胚肾细胞系HEK293,非洲绿猴肾细胞系COS-7及细胞培养相关试剂2、Northern杂交,Real-time RT-PCR及Western印迹杂交相关试剂3、基因克隆及荧光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂4、电泳泳动迁移实验(EMSA),染色质免疫沉淀(ChIP),DNA蛋白结合分析实验相关试剂5、糖皮质激素受体(Glucocortcoid receptor,GR)表达载体pRShGRα,Sp1表达载体pN3-Sp1,地塞米松(Dexamethasone,Dex,一种人工合成的GC),RU486(一种GR拮抗剂).
二、实验方法1、Northern杂交检测Dex刺激前后以及同时存在RU486情况下,HEK293细胞中hWNK4基因mRLNA表达变化;Real-time RT-PCR进一步验证确认;
2、克隆hWNK4基因启动子序列(-484～+62),构建荧光素酶报告基因载体p484-1uc,转染COS-7细胞,双荧光素酶活性检测系统分析COS-7细胞中单独转染GR,或单独Dex刺激,或转染GR同时以不同浓度Dex刺激对hWNK4基因启动子活性的影响;
3、生物信息学分析hWNK4基因启动子结构基础上,构建系列截短的hWNK4基因启动子荧光素酶报告基因载体,转染HEK293,通过双荧光素酶活性检测系统分析hWNK4基因各段启动子活性;
4、双荧光素酶活性检测系统分析HEK293中Dex刺激前后以及同时存在RU486对hWNK4基因启动子活性的影响;
5、EMSA体外鉴定hWNK4基因启动子内激素反应元件及Dex对GR与该反应元件结合力的影响,ChIP体内实验进一步验证确认;
6、对hWNK4基因近端启动子-275～+62区域构建更为精细的系列截短的荧光素酶报告基因载体,转染HEK293细胞,通过双荧光素酶活性检测系统分析,寻找hWNK4基因核心启动子,并结合生物信息学分析确定对hWNK4基因基础转录调控起关键作用的潜在顺式作用元件;
7、对确定的潜在Sp1作用元件进行定点突变,构建突变体荧光素酶报告基因p241m-1uc,双荧光素酶活性检测系统分析突变后启动子活性变化,以确认其功能;
8、DNA蛋白结合分析实验体外鉴定Sp1作用元件,ChIP体内实验进一步验证确认;
9、双荧光素酶活性检测系统分析RNA干涉敲减Sp1或瞬时转染过表达Sp1对hWNK4基因启动子活性的影响,Western印迹杂交检测Sp1表达水平;
10、Real-time RT-PCR检测RNA干涉敲减Sp1或瞬时转染过表达Sp1对内源hWNK4基因mRNA表达的影响。
结果：
1、Northern杂交和Real-time RT-PCR均显示Dex刺激24h后,HEK293细胞中hWNK4基因mRNA表达下降为空白对照的28-35％,同时加入GR受体拮抗剂RU486可以使mRNA水平恢复至接近空白对照水平,提示Dex通过GR介导下调hWNK4基因表达。
2、hWNK4基因启动子报告基因p484-1uc转染COS-7细胞,荧光素酶活性分析显示Dex呈GR依赖和剂量依赖方式抑制启动子活性。
3、生物信息学分析显示hWNK4基因启动子区无TATA盒,存在GR、Sp1、AP-1、GATA-1及C/EBP等多个潜在的转录因子作用元件;系列截短的hWNK4基因启动子报告基因荧光素酶活性分析提示hWNK4基因启动子区-337～-326和-285～-276为两个负调控元件,-484～-337,-325～-285和-275～+62为三个正调控区;
4、Dex单独或Dex和RU486共同刺激后,双荧光素酶活性分析表明hWNK4基因启动子区-337～-326和-285～-276两个负调控元件与GC的抑制作用密切相关。
5、EMSA和ChIP实验分别在体外和体内条件下证明GR结合到hWNK4基因启动子-337～-326和-285～-276区,并且Dex作用增强GR蛋白与这两个位点的结合。
6、荧光素酶报告基因表明hWNK4基因启动子-241～-202区域为核心启动子;生物信息学分析显示该区域存在一个潜在Sp1作用元件(-223～-214);
7、突变Sp1作用元件(-223～-214)使hWNK4基因启动子活性显著下降;
8、DNA蛋白结合分析实验和ChIP实验分别在体外和体内条件下证明-223～-214序列为Sp1作用元件。
9、RNAi敲减Sp1,hWNK4基因启动子活性降低;过表达Sp1,hWNK4基因启动子活性升高;
10、RNAi敲减Sp1,内源hWNK4基因mRNA表达降低;过表达Sp1,内源hWNK4基因mRNA表达升高。
结论：
1、糖皮质激素下调hWNK4基因转录,该下调作用由hWNK4基因启动子区的两个负性糖皮质激素反应元件(-337～-326和-285～-276)介导。
2、转录因子Sp1上调hWNK4基因转录,hWNK4基因启动子-241～-202区域为核心启动子,该区域内存在一个功能性的Sp1作用元件(-223～-214)参与介导该上调作用。