朱砂叶螨转录因子CncC调控CYP315A1介导的再猖獗分子机制研究

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朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,寄主广泛,危害严重。朱砂叶螨的防控多年来一直以施用化学农药为主,导致抗性问题日趋严峻。害虫(螨)抗药性(Resistance)的产生和再猖獗现象(Resurgence)是化学农药使用后的常见不良问题。本研究团队在对朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系的长期研究中,发现并证明了其解毒酶细胞色素P450活性增强是介导抗性的重要因素,且相关细胞色素P450的表达受转录因子CncC的调控。同时,还发现该品系存在生殖力提高的现象,且以P450为代表的生殖相关基因(CYP314A1和CYP315A1)也有过表达的事实。基于此,本研究结合转录因子CncC的生理功能,对朱砂叶螨一条生殖相关基因TcCYP315A1的表达调控进行了系统、深入的研究,以期阐释朱砂叶螨再猖獗的调控机制。具体的研究结果如下:1.通过荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)对TcCncC在朱砂叶螨不同品系下mRNA表达模式进行了分析,结果显示:(1)TcCncC在云南甲氰菊酯抗性品系(YN-Fe R)中的表达量是敏感品系(YN-SS)的2.2倍。(2)在朱砂叶螨的整个生长发育历期中,TcCncC在卵期具有较高表达量。(3)TcCncC在高温(34℃)条件下较室温时,表达量显著性差异提高,为1.57倍。2.采用叶碟饲喂法分别对转录因子CncC及其配体蛋白Maf,和CYP315A1进行RNAi研究,结果显示:当TcCncC的沉默效率为49%时,TcCYP315A1的表达量下调了73%,TcCYP314A1的表达量下调了50%;当TcMaf的沉默效率为75%,TcCYP315A1的表达量下调了59%,TcCYP314A1的表达量下调了26%。当TcCYP315A1的沉默效率为38%,Tcvg1的表达量下调了21%,Tcvg2和Tcvgr的表达量较阴性对照无显著性差异。再分别利用叶碟饲喂法和注射法沉默了TcCYP315A1基因的表达,分别观察了这两种方法处理下,成螨单雌每天的产卵量,在两种干扰方法下,处理组的生殖力曲线均低于对照组,表明沉默TcCYP315A1基因的表达后,朱砂叶螨的产卵量减少,生殖力下降。3.结合二斑叶螨(Tetranychus urticae)基因组数据和朱砂叶螨转录组数据克隆获得了(1)朱砂叶螨P450基因CYP315A1,该基因c DNA全长1590bp,编码529个氨基酸,预测的蛋白分子量为60.53 KDa,理论等电点为8.30,命名为TcCYP315A1;(2)TcCYP314A1和TcCYP315A1的启动子序列并预测到了转录因子CncC/Maf结合位点。借助荧光素酶报告基因研究了转录因子CncC对TcCYP314A1和TcCYP315A1基因启动子的调控作用,结果显示TcCYP314A1不受转录因子CncC的调控,TcCYP315A1的表达受转录因子CncC的调控。在此基础上,并进一步验证到了转录因子CncC与TcCYP315A1启动子结合的调控位点(CATGATACATAAATT),明确了CncC对TcCYP315A1的转录调控作用。4.在柑橘全爪螨(Panonchus citri)中,采用叶碟饲喂法对PcCncC进行RNAi研究,结果显示,当PcCncC的沉默效率为80%时,PcCYP315A1的表达量也下降了62.5%。同时,记录了其进入成螨期后单雌每天的产卵量,与对照相比,处理组的生殖力曲线低于对照。表明PcCncC也可影响PcCYP315A1的表达,进而影响其生殖能力,该调控通路可能在螨类中广泛存在。转录因子CncC在上调P450解毒代谢相关基因表达的同时,增加了生长发育相关基因TcCYP315A1的表达,表明CncC既可调控抗性基因又可调控生殖基因,是不同P450基因的共调控因子,使得朱砂叶螨对某些药剂(甲氰菊酯)产生抗性的同时,产生了再猖獗的现象。
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