研究背景和目的:人体呼吸系统与外界环境接触密切,易受空气中有害吸入物、细菌、病毒等侵袭引起各种急、慢性气道炎症疾病。而长期呼吸道慢性炎症疾病可引起支气管黏膜上皮杯状细胞化生、气道黏液高分泌、支气管迂曲阻塞、呼吸通气功能受损等一系列肺部病理改变,其中气道黏液高分泌对呼吸道慢性疾病的发展、转归意义重大。气道黏液是由水、离子、血浆蛋白渗出物等混合黏蛋白（mucin）组成的黏性胶状液体,能通过黏附气道内吸入的颗粒及微生物等方式起到保护和润滑呼吸道的作用。但过多分泌的气道黏液可损害黏液纤毛清除功能和局部防御功能,导致细菌定植、炎症感染难以控制和气体交换功能障碍。许多气道炎症疾病如慢性支气管炎、肺囊性纤维化、支气管哮喘、支气管扩张等都存在气道黏液高分泌状态。气道黏液高分泌状态下,组成分泌黏液的黏蛋白以气道杯状上皮细胞分泌的黏蛋白5AC（mucin 5AC,MUC5AC）为主;长期反复的气道炎症常可引起支气管上皮杯状细胞化生并分泌大量MUC5AC。MUC5AC是高度O-糖基化修饰的大分子糖蛋白,由富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸的蛋白主链和寡糖分支侧链组成,作为MUC5AC基因的产物其有着复杂的分子结构。O-糖基化是MUC5AC主要的翻译后修饰方式,使之形成复杂的分支网状分子结构,并赋予MUC5AC独特的结构特性和流变学特点。由于MUC5AC在气道炎症疾病发病机制中的重要意义,许多研究致力于改善气道黏液高分泌状态,希望通过减少炎症时的气道上皮细胞过多产生和分泌的黏蛋白来改善气道堵塞及细菌定植,从而利于排痰、抗感染及改善呼吸功能的临床治疗。但是在实际临床工作中我们发现患呼吸道炎症疾病的患者常常有咳痰困难症状,这种现象不仅与呼吸肌群疲劳、炎症分泌物位于末端呼吸道、支气管上皮纤毛清除功能受损、气道水分丢失等因素有关,还与气道内分泌的黏液质地过度黏稠致使黏液难以被清除有关。呼吸道分泌物粘稠度增加可加剧气道堵塞及细菌定植等一系列后续病理结果。黏蛋白糖基化修饰影响黏液质地,特别是MUC5AC异常糖基化可引起黏液质地粘稠难以被清除,同时气道黏液的分泌潜能与黏蛋白糖基化状态高度相关。故通过干预黏蛋白的糖基化修饰来改善气道黏液质地,以使其容易被气道纤毛清除系统排出,与抑制黏液高分泌一样意义重大。因黏蛋白糖基化修饰可影响其在上皮细胞基质内的移动速率;并且黏蛋白O-聚糖的长度及其电荷密度决定了分泌蛋白通过基质孔的流动性。Cosmc是MUC5AC糖基化修饰过程中重要糖基转移酶T-synthase的伴侣分子,它帮助T-synthase分子寡肽之间通过二硫键形成二聚体,并且助其分子结构折叠以形成具有活性的糖基转移酶,从而促进糖基化产物T antigen的生成和侧支糖链的延长,对糖基化修饰顺利进行意义重大。研究发现信号通路分子的活化,如Akt/ERK,与伴侣分子Cosmc的表达关系密切。以上信号通路分子常常在气道炎症因子的刺激下被活化从而促进气道上皮细胞内MUC5AC合成增加。所以我们希望通过此研究以Cosmc为切入点探讨炎症因子刺激及其活化的上皮细胞内信号通路因子,特别是中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）及其活化的下游信号因子,与黏蛋白糖基化修饰之间的关系,为进一步改善气道分泌物黏稠度、促进气道黏液排除的治疗方法寻找分子作用靶点及理论依据。本研究通过以下三个部分进行。第一部分炎症因子对Cosmc、T antigen表达的影响第一节气道急性炎症模型大鼠及人类气道上皮中Cosmc、T antigen的表达目的:通过免疫组化检测气道炎症模型大鼠及肺部炎症患者气道上皮细胞中Cosmc和T antigen表达情况,检测炎症反应是否能引起大鼠及人支气管上皮细胞中MUC5AC糖基化相关伴侣分子Cosmc和糖基化产物T antigen表达的增高,从而探讨气道炎症反应与黏液糖基化修饰的关联性。方法:1.用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激大鼠支气管,建立大鼠气道炎症模型,分离大鼠肺组织并石蜡切片,免疫组化检测大鼠肺组织石蜡切片中支气管上皮细胞内Cosmc和T antigen表达水平。2.收集肺癌患者癌旁肺组织,进行石蜡切片后运用免疫组化检测患有慢性肺部炎症疾病和未患肺部炎症疾病患者肺组织支气管上皮细胞中Cosmc和T antigen表达情况。结果:在气道炎症模型大鼠肺组织及人炎症肺组织气道上皮细胞中,Cosmc和T antigen表达强度均较对照组大鼠及未患肺部炎症疾病者高。结论:炎症反应能影响大鼠及人气道上皮中Cosmc和T antigen表达水平,炎症因子与气道黏液糖基化间存在相关性。第二节NE刺激与BEAS-2B细胞内Cosmc表达的关系目的:通过NE刺激支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞,检测胞内Cosmc与T antigen表达水平,进一步探讨炎症因子与气道黏液糖基化的相关性。方法:体外培养BEAS-2B细胞并予以炎症因子NE刺激,免疫印迹（Western blot,WB）、实时荧光定量反转录聚合酶链反应（Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-q PCR）、激光共聚焦检测细胞内Cosmc表达水平,凝集素相关电泳、凝集素相关细胞荧光免疫检测T antigen表达水平。结果:相较于对照组,予以BEAS-2B细胞NE刺激后,细胞内Cosmc和T antigen表达均升高。结论:NE刺激能影响气道上皮系BEAS-2B细胞内Cosmc和T antigen的表达水平,进一步证实炎症因子与气道黏液糖基化修饰之间存在关联。第二部分NE通过影响Cosmc表达、T-synthase活性以调节T antigen表达目的:通过抑制BEAS-2B细胞内Cosmc表达,探讨Cosmc在介导NE刺激的T antigen表达增高中的重要作用。方法:慢病毒携带短发夹状RNA（short hairpin RNA,sh RNA）转染BEAS-2B细胞,运用WB、PCR及荧光分析法检测转染细胞内T-synthase蛋白表达、基因转录及转移酶活性,凝集素相关电泳、凝集素相关细胞荧光免疫检测T antigen表达水平。结果:转染BEAS-2B细胞抑制Cosmc表达后,在NE刺激下,胞内T-synthase活性降低、T antigen表达无明显增加。结论:NE通过影响Cosmc表达水平来调控T-synthase活性及后续T antign合成。第三部分NE通过PI3K信号通路参与调节Cosmc和T antigen的表达目的:探讨信号通路分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase,PI3K）在NE刺激引起的Cosmc表达增高中的重要作用,以了解信号通路对Cosmc表达的调控及对T-synthase活性、糖基化产物T antigen生成的影响。方法:1.分别予以表皮生长因子受体（endothelial growth factor receptor,EGFR）、Ras、PI3K的激动剂和抑制剂为干预因子刺激BEAS-2B细胞,运用WB检测BEAS-2B细胞中磷酸化EGFR（phosphorylated EGFR,p-EGFR）、Ras、P85α、Cosmc表达水平。2.运用荧光检测法、凝集素相关电泳、凝集素相关细胞荧光免疫检测信号通路分子在NE、PI3K激动剂及抑制剂干预后,细胞内T-synthase活性及T antigen表达水平。结果:NE刺激能增强BEAS-2B细胞内信号通路分子p-EGFR、ras、P85α的表达,以及Cosmc表达增加。干预信号通路分子PI3K可影响糖基化酶T-synthase活性及糖基化产物T antigen的合成。结论:NE通过调控信号通路分子PI3K影响Cosmc表达,从而干扰黏蛋白糖基化修饰。