【摘 要】
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乳果糖是一种益生元,可作为功能性食品添加剂和治疗肝性脑病、慢性便秘等疾病的临床药物,现已广泛应用于食品和医药领域中。酶法生产相比于化学法生产既节能环保、又能减少副产物的生成,是乳果糖制备的新趋势。来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶（Cs CE）是目前制备乳果糖最高效的酶,其定点突变菌株E161D/N365P所产Cs CE,称为EDNP
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乳果糖是一种益生元,可作为功能性食品添加剂和治疗肝性脑病、慢性便秘等疾病的临床药物,现已广泛应用于食品和医药领域中。酶法生产相比于化学法生产既节能环保、又能减少副产物的生成,是乳果糖制备的新趋势。来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶（Cs CE）是目前制备乳果糖最高效的酶,其定点突变菌株E161D/N365P所产Cs CE,称为EDNP,具有更优的热稳定性。本文致力于EDNP的固定化研究,采用有机-无机（酶-金属离子）杂化固定化途径,制备出EDNP@Co3（PO4）2和EDNP@Ca2P2O7两种纳米花催化剂及食品级交联的SA-EDNP@Co3（PO4）2固定化酶,之后对三种固定化酶的理化特性进行表征,并结合场发射电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱等技术方法分析其结构,进一步考察了其在乳果糖制备中的应用。首先,采用有机-无机杂化纳米花固定化技术制备得到EDNP@Co3（PO4）2。在最佳制备条件下(0.1 mg/m L酶蛋白和1.6 m M Co2+),酶活回收率可达62.88%,酶结合效率为57.22%。向第一次沉淀后仍含有残余酶蛋白的溶液体系中继续加入0.8 m M Co2+,可进一步将总酶结合效率提高至65.82%,且纳米花结构完整。与游离酶相比,EDNP@Co3（PO4）2温度稳定性在60℃以下略有提高,最适p H向酸性区域偏移,有利于乳果糖的清洁生产。纳米花结构赋予EDNP@Co3（PO4）2更优的动力学参数,相比于游离酶,其催化效率η提升1.48倍,且循环反应8次后,酶活仍达到70%以上。以100 g/L乳糖为底物（固定化酶添加量3.5 U/m L）生产乳果糖,反应6 h后乳果糖转化率达到53.18%。其次,在EDNP@Co3（PO4）2的基础上用食品级交联的方法进行二次固定,进一步提高其操作稳定性,制备得到SA-EDNP@Co3（PO4）2。在循环8次后,其残余酶活仍为初始酶活的96.93%。将其应用于低温牛奶体系,在8℃下反应12 h,乳糖分解率达到44.65%,乳果糖和依匹乳糖总转化率为26.69%;55℃下,反应1 h后44.27%的乳糖被分解,乳果糖和依匹乳糖总转化率为28.32%。最后,在有机-无机杂化的基础上结合离子胶凝法,采用壳聚糖杂化纳米花固定化技术制备得到EDNP@Ca2P2O7。在最佳制备条件下（酶蛋白浓度0.15 mg/m L,三聚磷酸钠浓度125 mg/m L,壳聚糖浓度2.5 mg/m L）,酶结合效率达到97.23%,酶活回收率为88.63%。与EDNP@Co3（PO4）2纳米花相比,其最适温度提高10℃,变性温度Tm提高1.29倍,最大反应速度Vmax比游离酶略有提升。70℃下循环8次后其活性为初始酶活的58.19%。以100 g/L乳糖为底物（固定化酶添加量5 U/m L）生产乳果糖,反应6 h后乳果糖转化率达到58.04%。
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