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众所周知，玉米在保障国家粮食安全方面具有举足轻重的地位。当前，我国玉米育种种质基础狭窄已成为共识。起源于热带亚热带地区的玉米具有丰富的遗传变异，因此，拓宽种质的途径之一是引进热带、亚热带种质。然而因其具有光周期敏感性，在其在温带地区利用的主要障碍。鉴于比鉴定与光周期敏感相关的基因，解析其分子调控机制，对于全面解析光周期调控玉米开花时间的分子机制具有重要的理论意义。
在前期精细定位的基础上，本研究以黄早4（光周期钝感温带自交系）和CML288（光周期敏感热带自交系）为试验材料，通过图位克隆技术克隆了具有光周期敏感性的基因ZmDPS10-2;在长日照条件下，通过构建过表达转基因材料和基因敲除材料验证了该基因的功能;用ZmDPS10-2抗体进行了ChIP-Seq实验，通过数据分析，挖掘了ZmDPS10-2的结合元件，并发现了ZmDPS10-2作用于光周期敏感基因ZmNF-YA3的启动子区域;对ZmNF-YA3从功能分析及调控机制方面进行了一系列系统研究。以上研究为全面解析玉米光周期调控开花时间的分子调控机制及调控网络提供依据。主要的研究结果如下:
(1)在前期精细定位的基础上，从黄早4和CML288两个材料中克隆了光周期敏感基因ZmDPS10-2。通过序列比对发现:黄早4中扩增出来ZmDPS10-2基因cDNA序列长2008bp，包含一个长756bp的ORF，编码251个氨基酸;CML288中扩增出来ZmDPS10-2基因cDNA序列长1840bp，包含一个长774bp的ORF，编码257个氨基酸。两个材料中该基因的cDNA序列的5’非编码区存在个别碱基的突变;两个材料的编码区除了个别碱基突变外，CML288中缺少AG两个碱基，导致终止密码子后移，编码的氨基酸发生改变，但是保守结构域并没有发生改变;两个材料中该基因的3UTR比较发现，黄早4比CML288分别多出132bp、29bp、1bp和3bp。
(2)长日照条件下，以黄早4cDNA为模板，构建ZmDPS10-2基因的过表达载体，通过农杆菌介导的方法得到过表达转基因株系，通过田间调查，发现过表达转基因植株开花时间缩短了大约5.6天;运用CRISPR-Cas9系统，构建了基因敲除载体，通过农杆菌介导的方法得到基因敲除突变体，通过田间调查，发现基因敲除突变体开花时问显著延迟。说明在长日照条件下，ZmDPS10-2基因是玉米开花的正向调控因子，促进玉米开花。
(3)以ZmDPS10-2特异性抗体进行了ChIP-Seq实验，并对数据进行了分析，分析结果如下:通过MACS2检测到4102个峰(p＜0.05)，结合位点有CCAAT和CTTCGG。1598个峰(42.8％)位于基因上下游5kb范围内。其中32.1％位于启动子区域，0.5％位于5UTR，15.5％位于内含子区域，11.8％位于外显子区域，40.1％位于转录终止区域。1598个峰对应1142个基因，通过GO富集分析发现，这些基因主要参与了花发育、信号传导、DNA甲基化和刺激响应。在这1142个基因中，367个基因的启动子区域与Zm DPS10-2结合，这些基因参与光周期开花诱导、植物发育和生物非生物胁迫响应。367个基因中有21个转录因子和7个功能基因与光周期诱导及营养生长向生殖生长转换相关，ZmNF-YA3是其中之一。通过酵母单杂交和EMSA证明了ZmDPS10-2作用于ZmNF-YA3启动子区域，荧光定量PCR结果说明ZmDPS10-2正向调控ZmNF-YA3的表达。
(4)以光周期钝感温带自交系黄早4和光周期敏感热带自交系CML288为试验材料，克隆了ZmNF-YA3基因，将两个材料中扩增的ZmNF-YA3基因cDNA序列进行比对分析发现:黄早4中扩增出来ZmNF-YA3基因cDNA序列长1251bp，包含一个长903bp的ORF，编码300个氨基酸;CML288中扩增出来ZmNF-YA3基因cDNA序列长1250bp，包含一个长855bp的ORF，编码284个氨基酸。两个材料中该基因的cDNA序列的5’非编码区没有差异;两个材料的编码区除了个别碱基突变外，CML288中缺少一个C碱基，导致该基因编码区提前终止，编码的氨基酸发生改变，但是保守结构域并没有发生改变;两个材料中该基因的3UTR比较发现，两个材料中有三处碱基差异。
(5)运用CRISPR-Cas9系统，构建了ZmNF-YA3基因敲除载体，通过农杆菌介导的方法得到基因敲除突变体zmnf-ya3。在短日照条件下，zmnf-ya3突变体与(wild type)WT之间开花时间没有明显差异;在长日照条件下，zmnf-ya3突变体比WT开花时间平均晚4.9天。说明ZmNF-YA3是一个光周期敏感基因，并且在长日照条件下促进玉米提前开花。在长日照条件下，WT比zmnf-ya3突变体表现出更高的高温和干旱抗性。
(6)全基因组分析显示ZmNF-YA3与玉米基因组中的结合位点有6000多个，其中2259个与基因序列相关。通过酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)实验发现ZmNF-YA3与类CONSTANS(CO-Like)和开花促进因子1(FPF1)相互作用。实时定量PCR(qRT-PCR)结合酵母单杂交实验及EMSA表明NF-YA3可通过与玉米中的FLOWERING LOCUS T-like12(FT-like12)启动子结合而促进开花。此外，还发现ZmNF-YA3可以通过与ABA途径中bHLH92，FAMA，bZ1P45和茉莉酸活化剂MYC4的启动子区域结合来改善干旱和高温耐受性。
在前期精细定位的基础上，本研究以黄早4（光周期钝感温带自交系）和CML288（光周期敏感热带自交系）为试验材料，通过图位克隆技术克隆了具有光周期敏感性的基因ZmDPS10-2;在长日照条件下，通过构建过表达转基因材料和基因敲除材料验证了该基因的功能;用ZmDPS10-2抗体进行了ChIP-Seq实验，通过数据分析，挖掘了ZmDPS10-2的结合元件，并发现了ZmDPS10-2作用于光周期敏感基因ZmNF-YA3的启动子区域;对ZmNF-YA3从功能分析及调控机制方面进行了一系列系统研究。以上研究为全面解析玉米光周期调控开花时间的分子调控机制及调控网络提供依据。主要的研究结果如下:
(1)在前期精细定位的基础上，从黄早4和CML288两个材料中克隆了光周期敏感基因ZmDPS10-2。通过序列比对发现:黄早4中扩增出来ZmDPS10-2基因cDNA序列长2008bp，包含一个长756bp的ORF，编码251个氨基酸;CML288中扩增出来ZmDPS10-2基因cDNA序列长1840bp，包含一个长774bp的ORF，编码257个氨基酸。两个材料中该基因的cDNA序列的5’非编码区存在个别碱基的突变;两个材料的编码区除了个别碱基突变外，CML288中缺少AG两个碱基，导致终止密码子后移，编码的氨基酸发生改变，但是保守结构域并没有发生改变;两个材料中该基因的3UTR比较发现，黄早4比CML288分别多出132bp、29bp、1bp和3bp。
(2)长日照条件下，以黄早4cDNA为模板，构建ZmDPS10-2基因的过表达载体，通过农杆菌介导的方法得到过表达转基因株系，通过田间调查，发现过表达转基因植株开花时间缩短了大约5.6天;运用CRISPR-Cas9系统，构建了基因敲除载体，通过农杆菌介导的方法得到基因敲除突变体，通过田间调查，发现基因敲除突变体开花时问显著延迟。说明在长日照条件下，ZmDPS10-2基因是玉米开花的正向调控因子，促进玉米开花。
(3)以ZmDPS10-2特异性抗体进行了ChIP-Seq实验，并对数据进行了分析，分析结果如下:通过MACS2检测到4102个峰(p＜0.05)，结合位点有CCAAT和CTTCGG。1598个峰(42.8％)位于基因上下游5kb范围内。其中32.1％位于启动子区域，0.5％位于5UTR，15.5％位于内含子区域，11.8％位于外显子区域，40.1％位于转录终止区域。1598个峰对应1142个基因，通过GO富集分析发现，这些基因主要参与了花发育、信号传导、DNA甲基化和刺激响应。在这1142个基因中，367个基因的启动子区域与Zm DPS10-2结合，这些基因参与光周期开花诱导、植物发育和生物非生物胁迫响应。367个基因中有21个转录因子和7个功能基因与光周期诱导及营养生长向生殖生长转换相关，ZmNF-YA3是其中之一。通过酵母单杂交和EMSA证明了ZmDPS10-2作用于ZmNF-YA3启动子区域，荧光定量PCR结果说明ZmDPS10-2正向调控ZmNF-YA3的表达。
(4)以光周期钝感温带自交系黄早4和光周期敏感热带自交系CML288为试验材料，克隆了ZmNF-YA3基因，将两个材料中扩增的ZmNF-YA3基因cDNA序列进行比对分析发现:黄早4中扩增出来ZmNF-YA3基因cDNA序列长1251bp，包含一个长903bp的ORF，编码300个氨基酸;CML288中扩增出来ZmNF-YA3基因cDNA序列长1250bp，包含一个长855bp的ORF，编码284个氨基酸。两个材料中该基因的cDNA序列的5’非编码区没有差异;两个材料的编码区除了个别碱基突变外，CML288中缺少一个C碱基，导致该基因编码区提前终止，编码的氨基酸发生改变，但是保守结构域并没有发生改变;两个材料中该基因的3UTR比较发现，两个材料中有三处碱基差异。
(5)运用CRISPR-Cas9系统，构建了ZmNF-YA3基因敲除载体，通过农杆菌介导的方法得到基因敲除突变体zmnf-ya3。在短日照条件下，zmnf-ya3突变体与(wild type)WT之间开花时间没有明显差异;在长日照条件下，zmnf-ya3突变体比WT开花时间平均晚4.9天。说明ZmNF-YA3是一个光周期敏感基因，并且在长日照条件下促进玉米提前开花。在长日照条件下，WT比zmnf-ya3突变体表现出更高的高温和干旱抗性。
(6)全基因组分析显示ZmNF-YA3与玉米基因组中的结合位点有6000多个，其中2259个与基因序列相关。通过酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)实验发现ZmNF-YA3与类CONSTANS(CO-Like)和开花促进因子1(FPF1)相互作用。实时定量PCR(qRT-PCR)结合酵母单杂交实验及EMSA表明NF-YA3可通过与玉米中的FLOWERING LOCUS T-like12(FT-like12)启动子结合而促进开花。此外，还发现ZmNF-YA3可以通过与ABA途径中bHLH92，FAMA，bZ1P45和茉莉酸活化剂MYC4的启动子区域结合来改善干旱和高温耐受性。