葡萄糖阻遏(Glucose repression)是微生物界普遍存在的现象,酵母菌在漫长的进化过程中获得了优先利用高效碳源的机制,使它们拥有了适应环境条件变化的竞争优势。而从发酵工业的角度而言,这种葡萄糖的存在抑制酵母细胞利用其它碳源的机制,往往是影响原料利用率,降低生产效率的主要障碍之一。本研究从采自内蒙古地区的3份酸马奶(Koumiss)样品中筛选获得一株天然抗葡萄糖阻遏酵Kluyveromyces marxianus 246,通过RNA-Seq技术研究葡萄糖对KM246与对照菌株DSMZ5422基因表达影响及显著富集的代谢通路,解析其抗葡萄糖阻遏的分子机制。再通过乳糖酶活性及基因表达的差异,进一步验证KM246菌株的抗葡萄糖阻遏效应。优化确定了KM246菌株直投式发酵剂制备的工艺条件。获得研究结果如下:(1)抗葡萄糖阻遏酵母菌株的筛选及鉴定从内蒙古采集的3份传统酸马奶中筛选出一株具有抗葡萄糖阻遏作用的酵母菌,根据细胞和菌落形态、生理生化生物学特征,结合分子生物学方法鉴定其为马克斯克鲁维酵母(K.marxianus),将其命名为KM246。(2)抗葡萄糖阻遏菌株KM246的转录组分析通过将KM246和K.marxianus标准菌株DSMZ5422分别在单独碳源培养基(葡萄糖或乳糖)和混合糖培养基(葡萄糖和乳糖)上培养,根据残糖量曲线,对不同碳源和不同生长阶段的细胞进行转录组测序,分析了相关基因的表达水平及其调控机制。推测由于KM246菌株中Mig1基因表达量的降低,使受其调控的乳糖通透酶、乳糖酶以及半乳糖代谢网络中结构基因的转录得到解阻遏,所以乳源酵母KM246的相关基因获得适应性进化从而具有抗葡萄糖阻遏作用。(3)抗葡萄糖阻遏菌株KM246乳糖酶活性及基因表达研究本研究以DSMZ5422菌株为对照,分析KM246和DSMZ5422菌株乳糖酶活力和基因表达量变化趋势的差异性。结果表明,KM246与DSMZ5422在混合碳源培养基中的碳源利用情况、乳糖酶活力情况以及乳糖酶基因的表达量趋势基本相符,也从乳糖酶活力和表达量方面验证了KM246的抗葡萄糖阻遏作用。(4)KM246菌株直投式发酵剂的制备本研究以发酵剂冻干后的活菌数为指标,通过单因素实验和正交实验对KM246的冻干工艺进行优化。结果表明,增殖培养基条件为葡萄糖7%、硝酸钾3%、酵母粉2%、初始pH为8.0、接种量为2%,在30℃,225 r/min条件下培养20h后终止发酵,得到3.04×10~8 CFU/mL的高密度发酵液。保护剂最佳组合为脱脂乳粉10%、蔗糖7.5%、谷氨酸钠2.5%、甘露醇5%,6000 rpm离心15min后与保护剂按照5:1比例充分混合,-80℃预冻1 h后进行冷冻干燥,冻干时间为40 h时其含水率降至6.9%,在此条件下得到活菌数为4.4×10~8 CFU/g的干粉制剂,满足生产要求。