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目的支气管哮喘(哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞(EOS)浸润为主的气道反应性炎症和以气道高反应性(AHR)为特征的疾病,发病机制尚未完全阐明。目前认为,气道炎症是哮喘AHR的基础,而EOS是其关键的效应细胞,EOS在哮喘气道的聚集是哮喘发作的一个中心环节。近年来,支气管哮喘发病机制的研究有了很大进展,趋化因子在炎症反应中的作用日益受到重视,其特点是对多种炎性细胞具有趋化和激活功能。其中,嗜酸粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)及其受体CC趋化因子3(CCR3)对EOS具有选择性的趋化作用,在过敏性炎症反应中,Eotaxin通过与EOS上的CCR3特异性结合,促进EOS在气道募集及原位激活,并在Th2细胞因子协同作用下,共同调节哮喘气道炎症。细胞黏附分子极迟抗原-4(VLA-4)在炎症中介导白细胞的黏附和渗出,是目前国际公认的抗炎药物的新靶点。VLA-4参与炎症反应过程中炎症细胞的游走、浸润,VLA-4拮抗肽LDV(Leu-Asp-Val)在实验研究中显示出明确的抗炎效应,对哮喘的早期和晚期阶段的反应具有明显的抑制作用,KILDVA(Lys-Ieu-Leu-Asp-Val-Ala)是其衍生物。本研究旨在通过小鼠哮喘模型,观察VLA-4拮抗肽KILDVA经不同分子量PEG修饰后对哮喘小鼠气道上皮Eotaxin和CCR3的表达以及肺泡灌洗液(BALF)和血清中Eotaxin含量及EOS数的影响,同时筛选具有良好药效学特征的PEG修饰的VLA-4拮抗肽,为新型高效抗炎药物的研制和肽类药物的PEG修饰提供了基础。方法1. BALB/C小鼠180只,体质量18 g-20 g,随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组、mPEG5000-KILDVA组。采用卵清白蛋白(OVA)致敏建立小鼠哮喘模型。各组动物经腹腔注射给药。2.瑞士-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色法测定各组小鼠BALF中EOS数,用白细胞计数测白细胞总数,HE染色观察气道上皮病理学特征变化。3.酶联免疫吸附(ELISA)试验法检测各组小鼠肺泡灌洗液及血清中Eotaxin含量。4.采用免疫组化方法检测各组小鼠气道上皮Eotaxin和CCR3蛋白表达量的变化。5.采用原位杂交方法检测各组小鼠气道上皮Eotaxin和CCR3 mRNA表达的变化。结果1.各组小鼠BALF中白细胞总数、EOS数结果显示:模型组BALF中白细胞总数和EOS数绝对值较正常对照组显著升高,经统计学处理有显著差异(p<0.01);地塞米松组、KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组、mPEG5000-KILDVA组BALF中白细胞总数和EOS数绝对值明显低于模型组,经统计学处理有显著差异(p<0.05);KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组BALF中白细胞总数和EOS数绝对值高于地塞米松组,经统计学处理有显著差异(p<0.05);KILDVA组BALF中白细胞总数和EOS数绝对值高于mPEG2000-KILDVA组,经统计学处理有显著差异(p<0.05); mPEG5000-KILDVA组与地塞米松组相近,经统计学处理无显著差异(p>0.05)。2.各组小鼠气道上皮病理学改变HE染色结果显示:正常对照组小鼠气道上皮平整,无纤毛上皮脱落,气道管腔内未见炎性渗出,气道及血管周围未见炎细胞浸润,气管平滑肌无增厚;模型组小鼠支气管内可见大量粘液栓,气道粘膜下组织水肿,纤毛上皮脱落,气道壁和血管周围可见大量炎性细胞浸润,气管平滑肌增厚;地塞米松组、mPEG5000-KILDVA组气道壁和血管周围炎细胞浸润明显降低,气道粘膜下组织水肿、纤毛上皮脱落等表现较模型组明显改善;KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组气道壁和血管周围炎细胞浸润有所降低,气道粘膜下组织水肿、纤毛上皮脱落等表现改善不如地塞米松组、mPEG5000-KILDVA组明显。3.ELISA法检测各组小鼠肺泡灌洗液及血清中Eotaxin含量结果显示:模型组BALF及血清中Eotaxin含量明显高于正常对照组,经统计学处理有显著差异(p<0.01);地塞米松组、KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组、mPEG5000-KILDVA组BALF及血清中Eotaxin含量明显低于模型组,有显著差异(p<0.05),但仍高于正常对照组(p<0.05); KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组BALF及血清中Eotaxin含量高于mPEG5000-KILDVA组,有显著差异(p<0.05);KILDVA组与mPEG2000 -KILDVA组之间,有显著差异(p<0.05);mPEG5000-KILDVA组与地塞米松组相近,无显著差异(p>0.05)。4.免疫组化方法检测各组小鼠气道上皮Eotaxin和CCR3蛋白表达小鼠2%戊巴比妥钠0.2 ml腹腔麻醉,4%多聚甲醛灌流内固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,检测气道上皮Eotaxin和CCR3蛋白的表达。结果显示:模型组Eotaxin和CCR3蛋白的阳性表达单位(PU)明显高于正常对照组,经统计学处理有显著差异(p<0.01);地塞米松组、KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组、mPEG5000-KILDVA组Eotaxin和CCR3蛋白的阳性表达明显低于模型组,有显著差异(p<0.05),但仍高于正常对照组(p<0.05);KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组Eotaxin和CCR3蛋白的阳性表达高于mPEG5000-KILDVA组,有显著差异(p<0.05) ; KILDVA组Eotaxin和CCR3蛋白的阳性表达高于mPEG2000-KILDVA组,有显著差异(p<0.05);mPEG5000-KILDVA组与地塞米松组相近,无显著差异(p>0.05)。5.原位杂交方法检测各组小鼠气道上皮Eotaxin和CCR3 mRNA表达小鼠2%戊巴比妥钠0.2 ml腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛灌注内固定,石蜡包埋,冠状切片,采用原位杂交方法检测气道上皮Eotaxin和CCR3 mRNA的表达。结果显示:模型组Eotaxin和CCR3 mRNA的阳性表达(PU)明显高于正常对照组,经统计学处理有显著差异(p<0.01);地塞米松组、KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组、mPEG5000-KILDVA组Eotaxin和CCR3 mRNA的阳性表达单位明显低于模型组,有显著差异(p<0.05),但仍高于正常对照组(p<0.05);KILDVA组、mPEG2000-KILDVA组Eotaxin和CCR3 m RNA的阳性表达高于mPEG5000-KILDVA组,有显著差异(p<0.05);KILDVA组Eotaxin和CCR3 m RNA的阳性表达高于mPEG2000 -KILDVA组之间有显著差异(p<0.05); mPEG5000-KILDVA组与地塞米松组相近,无显著差异(p>0.05)。结论1.本实验建立的哮喘小鼠模型可模拟人类哮喘的发病过程,是研究哮喘比较理想的动物模型,对深入研究哮喘是可行的。OVA致敏和激发能引起哮喘小鼠气道上皮的病理性变化。2.哮喘模型小鼠中Eotaxin和CCR3表达增强是引起气道上皮EOS局部浸润及活化的重要因素,两者具有显著的正相关性。3.VLA-4拮抗肽KILDVA通过降低哮喘小鼠模型Eotaxin和CCR3蛋白含量以及mRNA在气道上皮的表达,降低哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液及血清中Eotaxin含量,降低BALF中EOS数,来干预气道炎症,从而达到治疗支气管哮喘的目的。4.mPEG5000-KILDVA与KILDVA、mPEG2000-KILDVA相比,表现出良好的抗哮喘作用。