我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位，烟草在国民经济中占有举足轻重的地位，是烟区农民增收、财政增税的主要来源，发展优质低害烟叶不管是对新农村建设还是对卷烟工业都有着十分重要的意义。烟碱是烟叶质量中最重要的化学成份，其含量直接决定烟叶内在品质、安全性和可用性。适宜的烟碱含量是优质低害烟叶生产所追求的目标，也是摆在烟草科技工作面前的一项紧迫任务。烤烟烟碱含量是遗传因素、生态环境和栽培技术共同作用的结果。长期以来，科技工作者对烟碱与气候、土壤等生态因子的关系等进行了较多研究，有关烟碱与化学成分、物理性状、吸食品质的关系也受到人们关注。但这些工作未在大范围内、多因子层面上进行研究。从小区域、单一生态类型的角度开展研究的报道较多，在大区域、多生态类型条件下研究烟碱与关联因子的关系较少。进行典型调查的多，进行试验研究的较少。本文在我国南北7个主产烟省的12个县，采用统一栽培技术模式，控制人为栽培措施，通过大量准确的田间试验，系统研究烤烟烟碱含量的关联因子。明确影响烟叶烟碱含量的主导生态因子和关联品质因素，为烤烟种植区域划分和合理布局提供理论依据，也为烟叶质量的评价和烟碱的农艺调节提供理论支撑。　　 烟叶减害是目前烟草界的共识和主攻方向，而降低烟叶中的烟碱含量一直是研究的热点。烟碱是衡量烟叶质量和安全性的关键指标之一，在常规技术措施降碱作用有限的条件下，用基因工程的手段，将编码烟碱合成的限速酶或具有调解功能的酶的基因导入烟草中，培育低烟碱优质烟草品种，是一条很有前景的新途径。本研究利用RACE技术，克隆了普通烟草类异黄酮还原酶(IRL))基因家族主要成员的全长cDNA和基因组序列，进行了系统的生物信息学分析，揭示了普通烟草中NtIRL基因家族成员数，阐明了这些基因在普通烟草各个组织器官中的表达特征，构建了超量表达和反义抑制表达植物载体，并通过遗传转化完成了功能验证。这将有助于烟草烟碱生物合成的总体分子生物学机理的进一步阐明，为烟碱的基因工程改良提供新的策略，推进低烟碱烟草分子育种，具有十分重要的理论和实践意义。　　 主要研究结果如下：　　 1烤烟烟碱含量的关联因子及相互关系　　 烟碱的积累受到其它化学成分的影响，烟碱含量只有适中并和其它化学成分的含量协调一致，才能获得优质烟叶。烟碱含量主要受烟叶中的总氮、总糖和还原糖调控，总氮为正效应，糖类为负效应，钾和钾氯比主要是通过间接效应对烟碱含量进行负作用调控，蛋白质主要是通过直接效应对各部位烟叶烟碱含量做负效应贡献。碱解氮、pH、有机质、全磷和速效磷是影响烟叶烟碱含量的主导土壤养分因子，碱解氮的作用最显著，其次为土壤pH。碱解氮、pH、有机质对烟碱含量做正效应贡献，全磷和速效磷对烟碱积累不利。气候和土壤是主要的生态因素，大范围内气候的作用更大，烟叶烟碱含量的主要关联气候因子是降雨量、平均气温、10cm地温、气温日较差和日照时数。降雨量是主要限制因子，对烟碱含量作负效应贡献，其余关联因子与烟碱含量正相关。烟叶中的B、P、Ca、Mo、Cu、Fe含量对烟碱含量影响明显。B能促进烟碱的形成，对烟叶烟碱含量做正效应贡献;提高烟叶中P的含量，可降低烟碱的含量；Ca对烟碱含量起负效应作用；Cu主要是对中、下部叶烟碱含量做负效应贡献。Fe、Mo元素对中部叶烟碱含量影响最大，有利于烟碱的积累。烟碱含量主要受次生致香物质中的杂环类、烷烃类、醇类和酮类调控。杂环类次生致香物质正效应，对烟碱含量的影响最大；烷烃类和醇类为负作用，酮类对下部叶烟碱含量做正效应贡献。烟碱含量与香气量的关系最为密切，呈极显著的正相关，与吃味和杂气关联度较小，对香气质不利。烟叶物理性状中的单叶重和单位叶面积对烟碱含量的影响最大，呈极显著正相关关系，含梗率和长宽比与烟碱含量关联度较小。　　 通过农艺措施调控烟碱含量时，必须要掌握好一个度，综合考虑对烟叶的香气量、香气质和关联次生致香物质的影响，不能顾此失彼。降低烟叶总氮含量，增加糖类和钾含量是中心目标；确定合理的单叶重和叶面积是重要前提；选择弱酸性、机质含量适中的土壤，控制施氮量，增施磷肥是中心措施；实施烟水配套，改善土壤水分状况是有效途径;通过无机元素调控烟碱含量应各有侧重，上部叶以调节P、Ca、B含量为主，中部叶以调节B、Fe、Mo、P、Cu含量为主，下部叶以调控Cu、B、Ca含量为主。　　 2 NtIRL基因家族成员的分子结构和同源性分析　　 采用RACE技术，以高烟碱品种龙里红花烟的根系总RNA为材料，克隆了普通烟草类异黄酮还原酶(NtIRL)基因家族的2个成员。NtIRL1和NtIRL2的全长cDNA分别为1257bp和1261bp，对应的基因组序列分别为1946bp和2089bp，均由4个内含子和5个外显子组成，遵循标准的GT……AG剪接方式。它们cDNA的79-1011bp处均有一个933bp的开放阅读框(ORF)。5UTR均为78bp，3UTR分别为246bp和250bp。它们3UTR中的AATGAA序列可能充当poly(A)加尾信号。　　 NtIRL1和NtIRL2基因组全长序列和ORF的一致性分别为84.9％和96.9%，编码区的一致性远远高于非编码区，证明了编码区的保守性。氨基酸水平的一致性和相似性分别高达95.5%和97.4%，说明蛋白水平存在高度保守性。NCBI Blastn同源分析表明，NtIRL1的mRNA对应于已报道的A622mRNA(D28505)，基因组序列对应于报道的NsA622基因(AB071165)，二者的对应区域完全相同，NtIRL2则为本研究新克隆。它们与来自大豆等植物的异黄酮还原酶(IFR)具有显著的同源性，NtIRL1和NtIRL2与GmIFR(AF202183)在ORF水平的一致性分别为67.6%和68.0%，氨基酸水平的一致性分别为63.0%和64.0%，氨基酸水平的相似性均达80.0%。与其它植物的PcBER酶有着一定的的同源性，与其它类型的还原酶也存在核心区段的同源性，表明这些酶的编码基因有原始的共同祖先。　　 3 NtIRL基因家族成员编码蛋白质的结构特征　　 NtIRL1和NtIRL2基因均编码一个310个氨基酸多肽，分子量分别为34.652kD和34.650kD，等电点分别为5.58和5.78。均以异亮氨酸的含量最高，半胱氨酸和色氨酸含量最低，两蛋白中酸性氨基酸数目略多于碱性氨基酸。NtIRL家族的2个蛋白是定位于细胞质的PIP蛋白，富含疏水氨基酸，N-末端都存在一段保守的NADPH特异性结合区域“GGTGYIG”，与其它典型PIP蛋白一样，都含有与辅因子及底物结合的氨基酸残基保守位点R38、K47、K13、R139、D276、只是在蛋白分子上空间位点发生了改变。NCBI保守域搜索结果，NtIRL家族蛋白的K8～G88和I9～T239区域都存在AdoHycase和NmrA两个保守性结构域。NtIRL1蛋白存在2个可能的跨膜结构域和11个潜在磷酸化位点，NtIRL2蛋白可能存在3个跨膜结构域和15个潜在磷酸化位点，磷酸化作用可能与蛋白活性有关。它们均没有信号肽，属于非分泌型蛋白。NtIRL家族蛋白存在丰富的化学修饰位点，在211位天冬酰胺残基上均存在预测显著的N-糖基化位点，各有4个蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，都有7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，均有2个酪氨酸激酶磷酸化位点，说明转录后修饰是NtIRL蛋白发挥正常功能的必要条件。NtIRL家族成员蛋白质的二级结构相似，主要由a螺旋、延伸链和随机卷曲构成，β转角所占比例很少。a-螺旋主要位于两个末端，在它们的中间部位存在1个较大的α-螺旋。随机卷曲穿插在其中，形成a-螺旋与随机卷曲相互交替的现象，延伸链主要位于随机卷曲之间。两个成员蛋白分子的三级结构几乎完全相同，具有PIP酶的典型的功能结构，预测的三级结构由N-末端区域和c-末端区域组成，在这两个区域中间有一个很大的裂口(Cleft)，是醇的重要结构特点，NADPH结合位点和底物特异性结合位点都在裂口表面，NADPH结合位点为NtIRL酶的供H位点，底物特异结合位点决定还原反应的特异性，说明催化反应是在裂沟中发生。　　 4 NtIRL基因家族的成员数　　 采用普通烟草品种龙里红花烟的基因组DNA为材料，分别用EcoRI、HindⅢ、SacⅠ和XbaⅠ四种限制性内切酶进行完全酶切，然后通过Southern blot杂交，结果表明在普通烟草基因组中NtIRL基因家族可能只存在2个成员，正是本研究所克隆的NtIRL1和NtIRL2。根据以往报道，野生林烟草中只有IRL1单拷贝基因存在，证实了普通烟草的确是林烟草和另一祖先烟草的融合体，林烟草至少为普通烟草直接提供了遗传物质，另一祖先烟草有待通过实验来证明。　　 5 NtIRL基因家族2个成员的转录表达特征　　 通过半定量RT-PCR检测NtIRL家族中各个成员在普通烟草中的时空表达情况，结果显示，NtIRL基因家族的成员间尽管同源性很高，但在表达的时空特性上发生了明显的分化。NtIRL1在根中表达表达量最高，茎中有适当表达，蕾中有弱的表达，在叶、花、蒴果和花后20大的种子等器官中完全不表达。NtIRL2具有更强的组织特异性，也是在根中表达最强，在茎中有极弱的表达，在蕾、叶、花、蒴果和花后20天的种子等器官均没有表达。NtIRL2在根中的转录水平明显高于NtIRL1。NtIRL家族中各个成员主要在根中优势表达，暗示它们在烟草根系次生代谢物质（如烟碱等）合成过程中具有重要作用，NtIRL2占主导地位。　　 6构建了两个正义植物表达载体和一个反义植物表达载体　　 采用SacI/BamHI双酶切定向克隆方式，将NtIRL1和NtIRL2全长基因组DNA序列成功构建到植物表达载体pCambia2301G中，CaMV35S启动子驱动，形成了这两个基因的正义植物表达载体，分别命名为p NtIRL1和pNtIRL2。　　 采用同样方法，成功将NtIRL家族共保守的一段1179bp反义片段构建到pCambia2301G中，CaMV35S启动子驱动，形成了反义共抑制所有NtIRL家族的植物表达载体，命名为pNtIRLA。　　 将目的基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得了携带相应植物表达载体的农杆菌工程菌株。正义和反义植物表达载体的构建成功，为进一步为揭示普通烟草NtIRL基因的功能，修饰烟草次生物质代谢途径相关的性状奠定了基础。　　 7 NtIRL基因家簇成员的功能分析　　 在构建了反义抑制和超量表达表达载体的基础上，通过农杆菌介导将目的基因转化普通烟草，初步研究了NtIRL基因的具体生物功能。超量表达和抑制表达的转基因烟草并没有出现明显的外型变化，具有正常的植株形态和生长特征，烟叶颜色与对照也无明显差别，暗示该基因可能在烟草次生代谢中具有重要作用。反义抑制的大伏烟和龙里红花烟转基因株系的烟叶烟碱含量较对照都有不同程度的下降，且与NtIRL基因的表达量存在明显的一致关系，表明NtIRL基因家簇成员得到了有效抑制，但不同转基因植株的烟叶烟碱含量下降幅度差异较大，大伏烟叶烟碱含量最低为对照的45.8%，龙里红花烟最低仅为对照的17%。超量表达NtIRL1和NtIRL2基因植株的烟叶烟碱含量绝大多数较对照都有不同程度的提高，且也与目的基因表达量存在明显的一致关系，但4个株系的叶片烟碱含量出现了降低，与目的基因的表达情况不一致。总体而言，转基因烟草叶片烟碱含量变化情况与NtIRL基因在根系中的表达丰度成正相关，说明NtIRL1和NtIRL2基因在烟草中是二个有功能的基因，都能够编码有活性的烟碱合成相关的酶，在烟草烟碱的生物合成代谢途径中有着重要作用。转NtIRL基因受体植株通过烟碱积累的改变影响了转基因植株的抗病表现，抑制NtIRL基因的表达，烟碱含量降低，烟株抗立枯病能力减弱：超量表达NtIRL1和NtIRL2基因，烟碱含量增高，烟株抗黑胫病能力增强。初步证实烟草次生代谢物中的烟碱除具有传统认为抗虫作用外，也是具有防御功能的植保素类物质，参与植物的防卫，但这还需要深入的研究来确证。