背景乙肝是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的严重危害人类健康的传染性疾病之一。我国HBsAg携带者超过1.2亿,其中慢性乙型肝炎携带者约三千万,每年约有100—150万人死于急慢性HBV感染。对这类患者目前尚缺乏有效的治疗方法,常导致患者病情迁延不愈,部分患者发展为肝硬化甚至肝癌,给社会和家庭带来极为沉重的负担。目前对于慢性乙型肝炎患者,主要还是通过抗病毒、免疫调节、改善肝功能和和抗肝纤维化等手段进行综合治疗,效果并不理想。因此接种乙肝疫苗是预防和控制乙肝病毒传播的重要措施。然而目前的乙肝疫苗还存在着以下几个问题:第一,现有疫苗不能打破乙肝患者或乙肝病毒携带者机体的免疫耐受并清除病毒;第二,对可能逃避现有疫苗保护作用的HBsAg变异株的存在还有争议;第三,在进行乙肝全程免疫的人群中,约有5%～10%的人不产生保护性抗体或抗体水平很低。近年来发展的乙肝DNA疫苗则有望解决这些问题。DNA疫苗同时具有类似减毒活疫苗的优点和灭活疫苗或亚单位疫苗的安全性,具有预防和治疗疾病的双重作用,近些年得到了快速而广泛的发展。然而就目前而言,其总的免疫效果仍不尽人意。比如,DNA疫苗在小动物实验中免疫效果较好,在大动物的实验中却效果欠佳;再者,尽管DNA疫苗在动物实验中能起到很好的免疫保护作用,但在临床试验中却不能保护受试者抵抗病原体的攻击。因此增强DNA疫苗的免疫效果是目前亟待解决的一个科学难题,而开发新型佐剂和缓释剂使之能够激发更强的细胞免疫是两种有效的手段。柚皮素具有抗菌、消炎、抗癌、解痉和利胆等作用。最近有研究报道柚皮素对急性免疫性肝损伤具有保护作用。目前对于柚皮素是否增强乙肝核酸疫苗免疫效果的研究报道很少。因此本论文首先就柚皮素能否作为乙肝核酸疫苗的一种新型佐剂开展了深入的研究,探讨了其增强乙肝核酸疫苗的免疫机制。另外,研究证实肽或蛋白质的聚乙二醇化,能够延缓其半衰期,增加其水溶性和稳定性。目前对于聚乙二醇能否对质粒DNA进行包裹并具有延缓作用仍然没有深入的研究。因此本论文的第二部分工作选择聚乙二醇作为发送系统对HBV DNA疫苗免疫效果开展系统的研究。目的本研究利用柚皮素作为佐剂,通过检测抗体水平,T细胞增殖的效果及体内细胞毒T淋巴细胞反应来评价其对乙肝DNA疫苗的影响,并通过细胞因子的检测,进一步阐明柚皮素增强乙肝DNA疫苗免疫效果的作用机理。同时研究聚乙二醇作为载体发送系统是否能够增强HBV DNA疫苗的细胞免疫和体液免疫效果。方法利用分子生物学技术构建含有HBV pre-S2和S基因的真核表达载体pVAX-S2,经测序确定载体构建成功后,用脂质体瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测293T细胞确定转染成功并表达S2基因后,我们将HBV DNA疫苗(pVAX-S2)单独或不同浓度的柚皮素联合HBV DNA疫苗(pVAX-S2),PEG/pVAX-S2免疫C57BL/6小鼠,在最后一次免疫14天时检测抗-HBs IgG、T淋巴细胞增殖、细胞因子表达及体内细胞毒T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标。结果成功构建含有HBV pre-S2和S基因的真核表达载体pVAX-S2。与仅免疫pVAX-S2比,不同浓度的柚皮素联合HBV DNA疫苗(pVAX-S2),PEG/ pVAX-S2能够增加免疫小鼠抗-HBs IgG水平;混合免疫组的T淋巴细胞体外经乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后,T淋巴细胞增殖数量显著高于对照组;另外,混合免疫组CD4+ T淋巴细胞中IL-4和IFN-γ以及CD8+ T淋巴细胞中IFN-γ的表达显著高于对照组。更重要的是,混和免疫组HBsAg特异性CTL显著高于对照组。结论研究结果显示,柚皮素不但增强乙肝DNA疫苗的体液免疫反应,而且增强细胞免疫反应。尤为重要的是,从治疗角度上来讲,1%柚皮素与DNA疫苗共同免疫组激发机体在CD4+或CD8+ T细胞中IFN-γ的产生,这将有利于慢性感染者体内病毒的清除和控制。研究中还发现,柚皮素增强了促炎症性因子IL-12的表达,下调了T淋巴细胞中抗炎症因子IL-35和TGF-β的表达,启动了TGF-β的下游信号分子Smad家族。因此,柚皮素可以给机体提供一个抑制性因素少的微环境,从而更有利于诱发外源抗原产生更强大的免疫反应。此外,柚皮素很容易与DNA疫苗混合并免疫动物,而且柚皮素作为中药制剂对动物几乎没有任何明显的不良反应。总之这些研究证实柚皮素不但增强了乙肝疫苗的细胞介导的免疫反应,增强了治疗作用,而且也进一步探索了其作用机制,这将为以后在应用生产实践中打下坚实的基础。同时发现PEG作为载体发送系统不仅能够增强机体的体液和细胞免疫反应,而且显著增强了体内CTL的杀伤活性,为进一步研究HBV DNA奠定了基础。