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1研究背景冠心病,又称为缺血性心脏病,其发作率高、致残率高、死亡率高,是严重威胁人类健康的疾病之一。祖国医学对于冠心病的用药施治,具有两千余年的丰富实践经验。双丹方由丹参、牡丹皮组成,为活血化瘀的经典古方之一,其系列制剂如双丹颗粒、双丹片、双丹口服液、双丹胶囊等长期应用于冠心病的临床实践,取得了良好的疗效。然而,迄今为止,相对于广泛开展的临床研究而言,双丹方的基础研究则相对滞后。与多数中药复方一样,双丹方所含化学成分复杂,有效成分至今尚不明了,治病的作用机理尚未阐明,限制了其进一步的应用及在国际上的推广。因此,阐明双丹方的药效物质成分及其治疗冠心病的作用机制,不仅可以为祖国医学复方配伍的科学合理性提供可靠的理论依据,也将为开发与国际接轨的成分清楚、靶点和作用机制明确的中药新药奠定坚实基础。本研究拟通过血清药物化学等研究手段,探寻双丹方的主要有效成分,在此基础上,通过对该方有效成分的药物动力学研究和抗心肌缺血的药效学研究,初步阐明该方的组方原理和作用机制。2方法2.1双丹方体外成分分析:建立双丹冻干粉的体外指纹图谱HPLC分析方法,色谱条件为:色谱柱ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm 5μm,Agilent),柱温30°C,流动相为甲醇与2%冰醋酸,采用梯度洗脱程序:甲醇-2%冰醋酸(5∶95,v/v)0 min,(5∶95)10 min,(25∶75)30 min,(40∶60)50 min,(60∶40)70 min,流速1 m L·min-1,进样量20μL,检测波长280 nm;以建立的HPLC分析方法对双丹冻干粉进行指纹图谱分析表征,确认各物质成分归属。2.2双丹方体内成分分析:采用血清药物化学的研究方法,建立双丹冻干粉经口灌胃后大鼠血清的HPLC指纹图谱,结合体外样品指纹图谱,分析比较双丹冻干粉给药后所得血清样品,鉴定双丹冻干粉大鼠血中移行成分。2.3丹参素配伍丹皮酚与独用丹皮酚的大鼠血浆药物动力学及组织分布特性:建立大鼠含药血浆及组织样品中丹皮酚的HPLC分析方法,色谱条件为色谱柱Sino Chrom ODS–BP C18(250 mm×4.6 mm 5μm,依利特),柱温30°C,流动相为甲醇-2%冰醋酸(70∶30,v/v),流速1 m L·min-1,进样量20μL,检测波长274 nm;以建立的HPLC分析方法对丹皮酚单独给药及丹参素配伍丹参素给药的大鼠血浆及组织(心、肝、脾、肺、肾和脑)匀浆进行检测,对比药物动力学参数的变化及其在组织中分布的特性。2.4丹参素配伍丹皮酚对异丙肾上腺素所致心肌损伤的保护作用及机制研究:大鼠连续给予丹参素(160 mg·kg-1)、丹皮酚(80 mg·kg-1)或丹参素配伍丹皮酚21天,于第20、21天采用皮下多点注射异丙肾上腺素(85 mg·kg-1)方法造成大鼠实验性心肌梗死模型,戊巴比妥麻醉(35 mg·kg-1)后记录心电图,取血和心肌组织分别检测c Tn I、CK-MB、LDH及TBARS、SOD、CAT等系列生化指标的变化。3结果3.1双丹方体外成分分析:双丹冻干粉指纹图谱中有11个共有特征峰,其中1、6和11号峰分别为源自牡丹皮的没食子酸、芍药苷和丹皮酚,2、3、4、5、7、8、9和10号峰分别为源自丹参的丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。3.2双丹方体内成分分析:大鼠口服双丹冻干粉后经鉴定有8种血清移行原型成分,分别为源自牡丹皮的没食子酸、芍药苷和丹皮酚,源自丹参的丹参素、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B,此8种成分将有可能成为双丹方药效作用的物质基础。3.3丹参素配伍丹皮酚与独用丹皮酚的大鼠血浆药物动力学及组织分布特性:丹参素配伍丹皮酚给药后血浆丹皮酚药物动力学参数及组织药物浓度较丹皮酚单独给药有显著改变,配伍给药后血浆丹皮酚浓度显著降低(P<0.01),药物平均滞留时间显著延长(P<0.001),表观分布容积显著增大(P<0.001),表明丹皮酚在心、脑及肺组织中的浓度显著升高(P<0.001)。3.4丹参素配伍丹皮酚对异丙肾上腺素所致心肌损伤的保护作用及机制研究:丹参素配伍丹皮酚对异丙肾上腺素所致的大鼠心肌损伤具有显著的保护作用,与模型组比较,各单用组及配伍组大鼠心梗面积、血清心梗标志物(c Tn I,CK-MB,LDH)水平、心肌组织TBARS水平、凋亡细胞数、凋亡相关Bax蛋白表达水平均显著下降(P<0.001),心肌组织抗氧化酶(SOD、CAT)活力、Ⅱ相解毒酶(GPx、GR、GST、NQO1)活力、抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平显著上升(P<0.001),心电图及心肌病理形态也得到显著改善;配伍组对各项指标的改善明显优于单用组(P<0.01或P<0.001)。4结论本研究分别采用血清药物化学、药物动力学手段、体内动物实验模型等方法,初步明确了双丹方的药效物质成分,证实了丹参素、丹皮酚配伍组合具有心肌保护作用,其机制可能与清除自由基、激活机体内源性抗氧化通路以及对凋亡相关蛋白表达的调控有关。上述研究结果为双丹方配伍作用的原理与科学合理性提供了实验依据,也为开发与国际接轨的成分清楚、靶点和作用机制明确的现代中药新药奠定了基础。