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M6A (N6-甲基腺嘌呤)是真核生物mRNA中含量最为丰富的甲基化修饰形式,约占所有甲基化修饰形式的80%。M6A去甲基化酶FTO (Fat mass and obesity associated) 和 ALKBH5 (α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5)的发现,证明了RNA上m6A甲基化修饰同DNA上的甲基化修饰一样是动态可逆的,因此,m6A逐渐被认定为表观遗传学的标记分子。m6A的形成具有序列特异性,主要发生于保守基序RRm6ACH([G/A][G> A]m6AC[U>A>C]),但是并非所有的此序列中的腺苷酸都能被甲基化,因此,必然存在着其他未知的机制对m6A的位点进行选择,而m6A甲基转移酶全酶复合物的鉴定将为m6A位点的选择性和特异性提供依据。已有研究发现m6A的形成是由一个组成尚不明确的蛋白酶复合体来催化的,METTL3是其中唯一已被鉴定的蛋白组分。本博士论文重点研究m6A甲基转移酶复合物的新组分及其调控mRNA代谢的分子机制。通过蛋白免疫沉淀技术结合质谱分析,鉴定了m6A甲基转移酶复合物的两个新组分WTAP (Wilms’tumor 1-associating protein) 和 METTL14 (Methyltransferase like 14)。其中,METTL14是METTL3的同家族蛋白,都含有SAM结合结构域和催化结构域。利用体内免疫共沉淀和体外GST-pull down技术,证明了METTL3 、METTL14 和 WTAP之间相互作用且不依赖于RNA和m6A修饰,而WTAP的N端结构域对其与METTL3 和 METTL14之间的相互作用起重要作用。进一步利用免疫荧光技术研究METTL3、METTL14 和 WTAP的细胞内定位,结果表明METTL3、METTL14 和 WTAP均定位于细胞核剪接因子富集的亚细胞结构核小斑,且METTL3 和 METTL14的核小斑定位受WTAP的影响；光活性增强的核糖核苷酸交联和免疫共沉淀技术(PAR-CLIP)实验也表明WTAP基因敲低的细胞中与METTL3结合的RNA明显降低,揭示了WTAP作为调节亚基招募METTL3-METTL14复合物结合到mRNA上通过PAR-CLIP技术结合二代高通量测序技术发现WTAP-METTL3-METTL14 (WMM)复合物在细胞内的主要作用底物是mRNA,且主要结合于mRNA的编码区以及3’UTR区域,与m6A的分布一致,其结合序列与m6A的保守序列也具有一致性,进一步表明WTAP在甲基转移酶复合物中起到重要的调节作用；对WTAP和METTL3共同调节的基因进行功能聚类分析,发现其中有很大一部分与RNA加工与代谢相关。另外,在斑马鱼胚胎中敲低WTAP和METTL3会导致胚胎发育异常和细胞凋亡增加,过表达外源的WTAP蛋白N端结构域能够回补因WTAP基因敲低造成的凋亡增加的表型,这与WTAP的N端结构域对其与METTL3-METTL14互作中的重要作用一致。这些新发现证明了WTAP作为调节亚基招募METTL3-METTL14催化亚基到mRNA上催化m6A的形成,并在RNA代谢的表观遗传调控中起重要的作用。综上所述,本研究发现了催化m6A形成的WMM甲基转移酶复合物,对后续深入研究m6A修饰的动态变化及调控RNA代谢的分子机制具有重要的生物学意义。