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第一部分Mi R-125a rs12976445位点单核苷酸多态性与乳腺癌患者生存率的相关性研究目的:Micro RNAs(miRNAs)可以通过负向调控靶基因的表达来发挥原癌基因或者肿瘤抑制因子的作用。在miRNAs编码基因内存在的遗传学变异使得个体具有了肿瘤易感性并影响到肿瘤病人的死亡风险。本文的研究目的是为了探讨我们筛选到的一些miRNA相关多态性是否与乳腺癌患者的生存率存在相关性。方法:1.我们收集了从2001年到2003年之间进行乳腺癌手术切除原发灶的患者信息及相关组织样本。经过前期筛选,最后保留了196个患者的组织样本进行后续分析。2.我们利用Qiagen公司的相关试剂盒在每一个患者样品的五个不同的组织区域(中央区,四周切缘)分别提取基因组DNA进行分析;并且使用聚合酶链式反应结合交联检测技术(polymerase chain reaction-ligation detection reaction,PCR-LDR)来对发现的SNPs进行基因分型;为了对每一个SNP进行详细分析,我们采用了共显性、显性和隐性等三种模型,并采用了相关的统计学分析方法对得到的结果进行统计学分析。结果:1.我们从196个乳腺癌患者中鉴定出五个miRNA的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)即miR-26a1 rs7372209、miR-125a rs12976445、miR-218rs11134527、miR-423 rs6505162和miR-608 rs4919510;2.在共显性、显性、隐性等模型中我们发现在这五个SNPs中只有miR-125a rs12976445与患者生存率之间存在显著相关性。然而,只有在共显性模型中该SNP才会与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期、雌激素受体和孕酮受体的表达存在相关性,而且这个效应在分层分析中仍然存在。结论:我们的研究结果为miR-125a rs12976445作为预测乳腺癌预后的潜在生物标志物提供证据支持。第二部分抑瘤素M对人乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响目的:以逆转录病毒为载体,研究抑瘤素M(Oncostatin M,OSM)基因对人乳腺癌细胞株(michigan cancer foundation-7,MCF-7)的生长抑制作用。方法:1.以最佳感染剂量携带OSM基因的逆转录病毒感染MCF-7人乳腺癌细胞,反转录酶-聚合酶链锁反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测目的基因在MCF-7人乳腺癌细胞中的转录。2.对感染后的MCF-7人乳腺癌细胞,以四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测OSM基因对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式法检测OSM基因诱导肿瘤细胞的凋亡效应,赫斯特(Hochest)染色法检测凋亡细胞的核形态改变,并用RT-PCR法进一步检测肿瘤细胞中Bcl-2、Bax及caspase-3等凋亡相关基因的表达。结果:1.利用逆转录病毒对MCF-7进行感染后在荧光显微镜下观察,确认100MOI作为病毒感染细胞的最佳感染剂量,而且感染率可达90%以上;2.转染后利用RT-PCR和ELISA法检测OSM的基因表达情况,发现实验组的OSM表达水平明显高于对照组;利用MTT法检测0~4 d的细胞生长活力,并绘制MCF-7细胞的生长曲线,发现相对于对照组,实验组细胞的生长明显受到抑制;将100MOI病毒感染MCF-7细胞72 h,利用Annexin V/PI双染结合流式细胞检测技术对细胞进行分选。结果显示,实验组诱导MCF-7细胞凋亡率明显高于对照组;用Hochest核荧光染色并荧光显微镜检测细胞凋亡的核形态学变化。结果显示:实验组细胞核出现溶解和碎裂,呈明显凋亡的形态学特征,而对照组和空载体组则未见明显异常;3.将100 MOI病毒感染MCF-7细胞,48 h后,收集细胞抽提总RNA,RT-PCR检测结果显示,相对于对照组,OSM组可引起MCF-7细胞中的Bax、caspase 3基因转录明显上调,而Bcl-2基因明显下调。结论:1.OSM基因能够显著的抑制肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡;2.OSM基因对MCF-7人乳腺癌细胞的生长抑制作用的机制可能与其上调凋亡促进蛋白Bax和caspase3,下调凋亡调控基因bcl-2有关。第三部分唑来膦酸通过STAT3和ERK信号通路下调VEGF表达而抑制血管生成目的:唑来膦酸抑制血管形成的确切靶点尚不清楚,本研究着重探讨唑来膦酸抑制血管形成的机制方法:1.以不同浓度的唑来膦酸处理脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),并利用反转录酶-聚合酶链锁反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、Brd U、Transwell等方法研究唑来膦酸对血管内皮细胞相关表型的影响。2.斑马鱼血管生成实验进一步验证唑来膦酸对血管生成的影响结果:1.与对照组相比,不同浓度的唑来膦酸确实影响到胚胎血管的构建程度,尤其是100μM时血管生成抑制率达到了34.6%;2.100μM唑来膦酸可以抑制原代内皮细胞增殖(49.5%)、迁移(44.8%)、管腔形成率(36.75%)。3.我们用不同浓度的唑来膦酸刺激血管内皮细胞15分钟,并检测STAT3和ERK1/2的表达情况。结果发现ERK1/2和STAT3的总蛋白和磷酸化蛋白的表达均有下降4.唑来膦酸剂量依赖性抑制原代内皮细胞VEGF因子的表达,同时显著的减少了VEGF因子的分泌水平。结论:1.唑来膦酸体内抑制斑马鱼血管生成;2.唑来膦酸抑制原代内皮细胞的增殖、迁移和官腔形成;3.唑来膦酸抑制原代内皮细胞ERK1/2和STAT3的激活;4.唑来膦酸抑制原代内皮细胞VEGF m RNA和蛋白的表达