老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)，是一种好发于中老年人的神经退行性变疾病，以记忆丢失和认知功能障碍为典型临床表现。其病因目前尚不清楚，大多认为是一种多病因疾病，与遗传、增龄、免疫功能异常、感染有关。随着研究的深入，发现尽管象AD等神经退行性疾病不被认为是经典的炎症或免疫系统介导的疾病，但在一定程度上自身免疫反应或炎症反应在AD的病因和病理过程中具重要作用。已在AD的神经病变中发现抗原提呈、人类组织相容性抗原(HLA)-DR阳性和其他免疫调节细胞、补体成分、炎性细胞因子(CK)及急性期反应物。而损伤的神经元和神经突触、Aβ沉积和神经原纤维缠结很明显正是特定皮质区慢性炎症的刺激物。另外，来自实验及临床的研究资料提示AD动物模型及AD患者的体液免疫反应和细胞免疫反应功能异常。AD患者与健康老年人血清和脑脊液中T、B及细胞因子等出现明显差异，表明免疫反应至少是AD的次级或终末过程，且可能参与了系统免疫反应。 本研究通过比较AD患者与健康老年人的体液免疫和细胞免疫的变化，为AD发病的免疫异常机制提供佐证，也为本课题组研发的Aβ疫苗实施AD免疫治疗的进一步研究提供临床依据。 1材料和方法 1.1 AD患者入选标准(NINCDS-ADRDA)及分型 (1)临床检查确认痴呆，MMSE(简易精神状态量表)，HDS-R(修订的长谷川智能量表)(<24)和ADL(日常活动量表)量表(>20)等神经心理测试支持； (2)2个或者2个以上认知功能障碍； (3)进行性加重的记忆和其它智能障碍； (4)无意识障碍，可伴有精神和行为异常； (5)发病年龄40～90岁； (6)排除其它可导致进行性记忆和认知功能障碍的脑部疾病，行头颅CT或MRI检查； (7)痴呆分型：MMSE<10为重度；MMSE得分在10～24范围内(其中包括10分和24分)为轻中度。 1.2实验分组 本实验研究对象AD患者和对照组均来自广州市老人院，从2006年6月至2007年4月。对照组为同期健康老人，共19例，平均年龄(69.80±2.28)(61～89)岁，其中男女比例为4/15，MMSE平均得分(27.86±1.61)(26～30)；研究组中随机选择AD患者29例，根据MMSE评分分型：MMSE<10归为重度AD患者组，共10例，平均年龄(76.00±3.69)(62～92)岁，其中男女比例为2/8，MMSE平均得分(2.64±1.58)(0～10)；MMSE得分在10～24范围内(其中包括10分和24分)归为轻中度AD患者组，共19例，平均年龄(75.82±2.54)(56～89)岁，其中男女比例为8/11，MMSE平均得分(16.3±2.71)(13～20)。所有被检对象均遵循知情同意和有关伦理要求。 1.3 AD患者血清中抗Ap42抗体的水平 分批于清晨8：00～9：00空腹状态下采集健康老年人和AD患者肝素钠抗凝静脉血5 ml，分离外周血单核细胞(PBMC)，取最上层分离的血清，分装置-70℃冻存。间接ELISA法检测健康老年人和AD患者血清中抗Aβ<,42>抗体的水平。 1.4.AD患者外周血细胞亚群和细胞因子的变化 分批于清晨8：00～9：00空腹状态下采集健康老年人和AD患者肝素钠抗凝静脉血5 ml，分离外周血单核细胞(PBMC)，流式细胞仪检测细胞亚群水平；Aβ<,42>与外周血单核细胞(PBMC)共刺激培养，ELISA双抗体夹心法检测经Aβ<,42>刺激的PBMC培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平；ELISPOT检测经Aβ<,42>刺激的PBMC中分泌IFN-γ和IL-4细胞频数。 1.5统计学分析 所得数据结果用均数±标准差(x±s)表示，利用SPSS10.0统计软件分析，P<0.05认为有统计学意义。计量资料多组均数比较采用方差分析。 2结果 2.1 AD患者血清中抗Aβ<,42>抗体水平的变化 ELISA检测结果表明，对照组、轻中度AD组、重度AD组血清中抗Aβ<,42>抗体A值分别为1.05±0.31、0.84±0.31和0.64±0.14。轻中度AD组、重度AD组与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.013<0.05和P=0.004<0.01)。轻中度组与重度组比较，差异亦有统计学意义(P=0.035<0.05)。 2.2 AD患者外周血淋巴细胞亚群和细胞因子的变化 流式细胞仪检测结果显示，对照组、轻中度AD患者组、重度AD患者外周血单个核细胞CD19分别为(15.64±9.30)﹪、(11.44±4.33)﹪和(11.06±5.62)﹪：CD4分别为(42.50±11.60)﹪、(29.0±8.27)﹪和(26.83±5.70)﹪；CD8分别为(16.88±7.29)﹪、(21±5.78)﹪和(23.78±13.19)﹪；CD4/CD8分别为2.24、1.38、1.27。综合比较，轻中度AD组及重度AD组CD8较对照组均显著性升高(P=0.048<0.05和P=0.035<0.05)；而轻中度、重度AD组CD4较对照组显著降低(P=0.015<0.05和P=0.006<0.01)；轻中度、重度AD组CD19与对照组比较仅轻微下降，差异无显著性；轻中度、重度AD组CD4/CD8较对照组显著降低(P=0.034<0.05和P=0.026<0.05)。轻中度AD组和重度AD组之间CD19、CD8、CD4及CD4/CD8差异均无显著性(P=0.913>0.05、P=0.665>0.05、P=0.624>0.05和P=0.504>0.05). 对照组、轻中度AD组、重度AD组体外培养的PBMC经特异性抗原Aβ<,42>刺激后，细胞培养上清液中IFN-γ的含量分别为(76.13±24.15)pg/ml、(30.53±7.88)pg/ml、(26.74±5.35)pg/ml。轻中度和重度AD组细胞培养上清液中IFN-γ的含量较对照组的细胞培养上清液中IFN-γ的含量低，且有显著性差异(P=0.045<0.05和P=0.032<0.05)；重度AD组细胞培养上清液中IFN-γ的含量较轻中度AD组细胞培养上清液中IFN-γ的含量低，但无显著性差异(P=0.478>0.05)。体外培养的三组PBMC经特异性抗原Aβ<,42>刺激后，细胞培养上清液中IL-4均<4 pg/ml，与众多文献报道结果一致。三组体外培养的PBMC经特异性抗原Aβ<,42>刺激后，每4×10<5>个PBMC中分泌的IFN-γ的细胞数分别为15.06±7.22、6.42±4.63、5.83±7.78；分泌的IL-4的细胞数均未检测出。轻中度AD组和重度AD组分泌IFN-γ的细胞较对照组分泌IFN-γ的细胞少，且轻中度AD组和重度AD组与对照组比较，有显著性差异(P=0.007<0.01和P=0.003<0.01)，轻中度AD组分泌IFN-γ的细胞较重度AD组分泌IFN-γ的细胞多，两组比较，差异无显著性(P=0.817>0.05)。 3结论 1.AD患者血清中抗Aβ<,42>抗体水平明显下降，且与病情程度有关，表明AD患者与健康老年人之间Aβ特异性的体液免疫应答存在显著差异，AD患者的特异性的体液免疫应答较健康老年人显著下降。 2.AD患者与健康老年人外周血PBMC的CD表面标志分子也存在差异，轻中度及重度AD患者CD8显著性升高、CD4和CD4/CD8显著降低；而CD19变化不明显。但轻中度和重度AD患者之间，外周血中CD19、CD4、CD8及CD4/CD8差异无显著性。表明轻中度AD患者及重度AD患者外周淋巴细胞亚群发生改变。 3.体外培养的AD患者与健康老年人外周血PBMC经特异性抗原Aβ<,42>刺激后，细胞培养液中IL-4均<4 pg/ml。AD患者细胞培养液中IFN-γ的含量降低，以重度AD患者较为明显，但与轻中度AD患者比较无显著性差异。表明特异性抗原Aβ<,42>能有效刺激体外培养的三组。PBMC分泌IFN-γ，并从细胞因子的总体水平上证实了AD患者的Aβ<,42>特异性细胞免疫功能受损。 4．体外培养的AD患者与健康老年人外周血PBMC经特异性抗原Aβ42刺激后，轻中度和重度AD患者每4×10<5>个PBMC中分泌IFN-γ的细胞明显减少，以重度AD患者组明显。体外培养的AD患者与健康老年人外周血PBMC经特异性抗原Aβ<,42>刺激后，分泌IL-4的细胞数均未检测出。从单个细胞水平上验证了AD患者的Aβ<,42>特异性细胞免疫功能受损。