一、背景和目的1、维生素D(Vitamin D)是人体一种必需的维生素,其活化代谢物为1,25—(OH)2D3。维生素D缺乏在世界范围内普遍存在,约为30-50%。以维生素D3<20 ng/mL定义为维生素D缺乏,以维生素D3在20-30ng/mL之间定义为维生素D不足,以维生素D3大于30ng/mL定义为维生素D正常。多年来,人们对维生素D的研究仅集中在对钙磷、骨代谢的调节。但近20年来,国内外多个研究发现活性维生素D具有免疫调节功能,是一种新的神经内分泌—免疫调节激素,对细胞免疫具有重要的调节作用,主要表现在对单核／巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及胸腺细胞增殖分化的影响和这些细胞功能的影响。2、维生素D受体(VDR)是类固醇—甲状腺激素的核受体超家族的成员,广泛存在于人体的多种组织细胞中,子宫、卵巢、胎盘等部位也发现了VDR,主要介导维生素D对靶细胞的生物效应。除经典的调节肾、肠管钙—磷代谢外,还在促进胚胎发育和成熟,免疫系统调节,抑制细胞坏死、肿瘤浸润和转移,调节细胞增殖和分化等方面起重要作用。3、稽留流产是指胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内未能及时自然排出者,是流产中的一种特殊类型,是妇产科常见疾病。国内稽留流产的发生率大约13.4%,已经成为重要的公共卫生问题。近代生殖免疫学研究表明,稽留流产除常见的染色体异常、环境因素、内分泌异常、感染因素外,还与免疫因素有关。免疫因素包括自身免疫型和同种免疫型。同种免疫型即排除了染色体异常、解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染、自身免疫疾病等病因的流产,临床上称为不明原因流产。从免疫学角度看,妊娠过程如下：带有父方异性抗体的胚胎对母体而言是一种移植物,母体免疫系统识别并产生保护性免疫应答,直至胎儿娩出。4、不明原因稽留流产的发生与CD4+T细胞介导的细胞免疫增强有关,已知CD4+T细胞又可分为Thl和Th2两类亚群细胞,Thl细胞分泌白介素—2(IL—2)、干扰素—γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等,以IFN-γ为主,它们的功能主要是促进细胞免疫,参与细胞免疫为主的免疫性疾病。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL—13等,以IL—4为主,它们的功能主要是促进体液免疫,在以抗体形成为主的体液免疫中起重要作用。Th1、Th2细胞亚型相互制约,决定着机体细胞免疫与体液免疫间的平衡,这种平衡一旦打破,将导致疾病的发生,即妊娠失败该病的发生。研究发现,正常妊娠母体细胞免疫功能抑制,体液免疫功能增强,Th1/Th2细胞比值向Th2细胞方向偏移,Th2细胞优势环境对妊娠有利,而Thl细胞因子具有胚胎毒作用,能阻碍早期胚胎的发育,导致病理性妊娠。普遍认为Thl类细胞因子可导致流产,Th2类细胞因子则对维持正常妊娠有重要作用。5、维生素D能调节抗原呈递细胞(APC),诱导免疫耐受；影响细胞因子的分泌,白细胞介素—4(IL—4)水平显著增高,干扰素—γ(IFN-γ)显著减少；抑制活性诱导的细胞死亡,从而起到免疫抑制的作用。6、本实验目的是通过检测不明原因稽留流产患者及正常早孕孕妇的血清维生素D3、IFN-γ、IL-4、全血T淋巴细胞亚群及蜕膜组织中维生素D受体,探讨维生素D3及其受体与不明原因稽留流产免疫学相关性。为稽留流产的防治提供理论依据。二、方法1、选取2014.7-2015.7在深圳市罗湖妇幼保健院就诊的符合以下标准的稽留流产及早孕孕妇,稽留流产患者作为流产组,50例。入组条件：①孕10-12周通过超声发现胚胎停止发育,无心管搏动；②夫妇双方和(或)胚胎染色体正常；③月经周期正常；④性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查均正常；⑤排除生殖道感染性疾病,如霉菌、支原体、衣原体等感染；⑥巨细胞病毒、弓形虫等病原体检查IgM均为阴性；⑦检查抗磷脂抗体为阴性排除抗磷脂综合征。以10—12周活胎要求终止妊娠者作为正常对照组,50例。入组条件：①此次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征；②超声证实胚胎发育正常,有心管搏动。样本排除标准：①既往有自然流产、死胎、死产史；②有家族遗传病史；③妇科检查、超声检查器质性病变和生殖器官解剖畸形遗传；④有性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌方面的异常或自身免疫性疾病史；⑤有生殖道感染性疾病,如霉菌、支原体、衣原体等感染；⑥有巨细胞病毒、弓形虫等病原体检查IgM其中一项为阳性；⑦检查抗磷脂抗体为阳性可疑或确诊抗磷脂综合征。2、通过抽取两组入选者的外周静脉血血清检测维生素D3.IFN-γ、IL-4,全血用于CD4+、CD8+流式细胞检测。再通过清宫术取两组入选者的蜕膜组织行免疫组化查维生素D受体表达,数据经整理后应用SPSS16.0软件进行统计学分析,双侧检验水准取P=0.05.两组间的计量资料比较采用t检验。两组间或多样本间的计数资料比较采用x2检验。各指标间相关性分析采用简单直线回归和相关性分析。三、结果入选的流产组和对照组的例数各50例,统计结果如下：1、流产组的血清CD4+/CD8+为明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.024<0.05)；流产组的血清IFN-γ明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.012<0.05)；流产组的血清IL—4明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.002<0.05)；流产组的血清维生素D3为明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.009<0.05)2、维生素D3与IL—4呈正相关,维生素D3与CD4+/CD8+、IFN-γ呈负相关。3、将100例样本进行按维生素D3浓度四分位分组,上四分位组,流产率为72%,下四分位组,流产率为32%,上四分位组和下四分位组经卡方检验,x2=8.013,双侧P=0.01<0.05,上四分位组与下四分位组的流产发生率有统计学意义可认为两样本流产率有显著差异。4、以维生素D3<20 ng/mL定义为维生素D缺乏,以维生素D3在20-30ng /mL之间定义为维生素D不足,以维生素D3大于30ng／mL定义为维生素D正常。将所有维生素D缺乏、不足及正常的样本,经卡方检验,维生素D缺乏组、维生素D不足组及正常组的流产发生率有统计学意义,x2=6.741,双侧P=0.028<0.05。5、在蜕膜组织中有维生素D受体表达76例样本中,流产组36例,对照组40例,流产组的血清CD4+/CD8+高于对照组,差异有统计学意义(P=0.024<0.05)；流产组的血清IFN-γ明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.023<0.05)；流产组的血清IL一4为明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.020<0.05)；流产组的血清维生素D。明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.048<0.05)；流产组的蜕膜维生素D受体水平低于对照组,差异无统计学意义(P=0.558>0.05)。6、在蜕膜组织中无维生素D受体表达样本24例中,流产组14例,对照组10例,流产组的血清CD4+/CD8+高于对照组,差异无统计学意义(P=0.734>0.05)；流产组的血清IFN-γ高于对照组,差异无统计学意义(P=0.537>0.05)；流产组的血清维生素D3为低于对照组,差异无统计学意义(P=0.06>0.05)；流产组的血清IL—4为明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.024<0.05)。四、结论1、不明原因稽留流产的发生与CD4+T细胞介导的细胞免疫增强有关,存在维生素D3缺乏。血清中维生素D3含量与稽留流产有相关性。维生素D缺乏导致稽留流产是通过改变CD4+/CD8+比例,影响细胞免疫平衡,打破Thl/Th2平衡起作用的。2、妊娠妇女普遍存在维生素D3缺乏和不足。在维生素D3缺乏组、不足组及正常组之间流产率有显著差异。3、当蜕膜组织可以表达维生素D受体时,血清中维生素D3含量与稽留流产有相关性。但蜕膜组织维生素D受体的表达的数量与稽留流产相关性仍有待进一步研究。