一、目的 神经轴膜钠、钾离子通道是神经冲动在有髓纤维跳跃式传导的分子基础，在周围神经脱髓鞘疾病的研究中，对轴膜离子通道关注较少。体外研究发现，淋巴细胞离子通道Kv1.3和IKCal对于启动和维持免疫反应至关重要，两者是免疫抑制的潜在靶点，但目前尚未有体内研究的相关报道。雷公藤多甙是较为成熟的免疫抑制剂，其对GBS的疗效尚不清楚。在本项实验中，我们拟利用EAN模型，研究周围神经轴膜离子通道与神经功能的关系，自身免疫状态下淋巴细胞离子通道与免疫功能的关系，并观察雷公藤多甙的疗效。 二、方法和结果 1．第一部分：EAN大鼠周围神经轴膜离子通道与神经功能的关系 提取牛周围神经髓鞘(BPM)免疫雄性Lewis大鼠诱导EAN模型，随访观察模型临床行为学改变，在免疫后第9、16、23、30、44和85天观察坐骨神经组织病理、单神经纤维钠、钾离子通道、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和半乳糖脑苷脂(GalC)的免疫组化，测定坐骨神经复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期、波幅、时限和运动神经传导速度，分析其相关性。结果发现：(1)EAN大鼠大致在免疫后第9天出现疾病征象，第16天达到顶峰，44天时基本恢复。(2)免疫后第9天，坐骨神经传导速度已经下降，16天时CMAP波幅降低、时限延长，23天时潜伏期延长，44天时4个指标的异常达到顶点，此后缓慢恢复。(3)免疫后第16天，EAN大鼠坐骨神经偶见炎性细胞和脱髓鞘纤维；23天时，神经束有大量密集的炎性细胞浸润，伴有成片的严重神经纤维破坏，髓鞘碱性蛋白(MBP)和神经丝(NF)染色显示髓鞘和轴索均受累；第44天，炎性反应基本消失；85天时坐骨神经已无明显异常。(4)EAN大鼠的单神经纤维免疫组化在免疫后第9天出现明显异常：钠、钾离子通道染色普遍减弱，伴有结旁段髓鞘的MAG染色减弱；16天时，GalC着色的雪旺氏细胞膜由锐利转为模糊，偶见髓鞘层波纹状剥脱；23天时，大量髓鞘呈泡沫样变性，钠、钾通道和MAG染色基本消失；30天时变性髓鞘呈波纹状外观和节段性脱失，离子通道和MAG染色偶见；第44天，髓鞘异常已不明显，大多数神经纤维的相应区域有离子通道着色，但着色的形式异于正常，染色区域小，着色浅；85天时离子通道染色仍然没有恢复至正常水平。(5)相关性分析，钠、钾离子通道与髓鞘蛋白MAG的相关系数最高(约0.96)，与坐骨神经远端CMAP波幅的相关系数次之(约0.82)，与轴索NF和临床症状的相关系数较低(约0.6)。2．第二部分：EAN大鼠淋巴细胞离子通道与细胞及体液免疫功能的关系复旦大学博士研充生学位论文 从EAN大鼠的腹股沟淋巴结和脾脏分离出淋巴细胞，用半定t RT-PCR检测两种细胞在免疫后第9、16、23和30天淋巴细胞离子通道Kvl .3和仪Cal的mRNA表达;上述原代细胞经CFSE染色后，分别加入无关蛋白、有丝分裂原ConA和LPS、特异性抗原BPM以及GMI，与空白对照一起培养72小时后，流式细胞仪测定增殖细胞比例;ABC一间接ELIsA法测定模型血清BPM和GMI抗体水平;计算上述指标的相关系数。结果发现:(l)免疫后第16天，对照组和EAN组的淋巴细胞在未加刺激物的培养中存在明显基础增殖，23天时达到顶峰，其中淋巴结细胞的基础增殖在各个时间点均高于脾脏细胞:有丝分裂原和特异性BPM明显增加了淋巴细胞的增殖比例，BPM对淋巴结细胞的作用强度超过有丝分裂原;从第16天开始，EAN组的基础增殖水平要显著高于对照组，同时有更多的原代细胞能够被有丝分裂原和BPM诱导分裂.(2)免疫后第9天， EAN大鼠已有高水平的BPM血清抗体，但检测不到GMI抗体。(3)Kvl.3和IKCal的mRNA在对照组和EAN组的淋巴结及脾脏淋巴细胞中均有表达，表达量在23天时达到顶峰;其中，淋巴结细胞两种离子通道的表达t高于脾脏细胞，IKCal在两种细胞中的表达量高于Kvl .3。从第16天开始，EAN组的两个离子通道表达量在两种细胞中均明显高于对照组。(4:)相关性分析，两种离子通道与淋巴结细胞增殖比例的相关系数要略高于脾脏细胞，分别为0.8刃.9和0.8左右，但两种通道之间无明显差别;离子通道与未经刺激的基础细胞增殖比例的相关系数要高于经刺激的细胞增殖比例，但各种刺激物之间差别不明显.(2)离子通道与血清抗体水平的关系不如与细胞增殖反应密切，相关系数在0.7左右。(3)离子通道与临床行为学评分的关联度较低，仅有O，4刃.5。3.第三部分:雷公藤多贰干预对EAN大鼠周围神经结构、功能和免疫状态的影响 将模型大鼠分为对职组、EAN组和雷公藤多贰(什)干预组，干预组于免疫后第9天给予TP 40m叭g体剪天灌胃，其余两组同时予等量生理盐水.TP连续给药两周，在免疫后第23天，检测以下指标:临床行为学评分、坐骨神经电生理指标、坐骨神经组织病理、单纤维免疫组化、淋巴细胞增殖实验、淋巴细胞离子通道mRNA表达和血清抗体水平。结果表明:(l)干预组的病程和临床症状程度与EAN组无明显差别。(2)干预组远端 cM叭p潜伏期、波幅和时限均较EAN组明显好转，波形离散度降低。(3)干预组周围神经的炎性反应，妞鞘破坏和轴索变性明显少于EAN组。(4)干预组单神经纤维上的钠、钾离子通道较.EAN组明显增加，翻鞘破坏则显著减少。(5)干预组淋巴细胞的基础?