【摘 要】
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甲基对硫磷水解酶（EC 3.1.8.1,简称MPH）是一种可以催化水解甲基对硫磷等有机磷化合物的酶,属于β-内酰胺酶家族。目前,MPH被应用于治理有机磷农药污染的水与土壤、制备高灵敏度有机磷酶传感器及功能性清洗剂等。本研究以Pseudomonas sp.WBC-3来源的MPH为研究对象,在Escherichia coli中表达并纯化,研究MPH的酶学性质及K+促进MPH酶活提高的机理,并通过点突变
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甲基对硫磷水解酶（EC 3.1.8.1,简称MPH）是一种可以催化水解甲基对硫磷等有机磷化合物的酶,属于β-内酰胺酶家族。目前,MPH被应用于治理有机磷农药污染的水与土壤、制备高灵敏度有机磷酶传感器及功能性清洗剂等。本研究以Pseudomonas sp.WBC-3来源的MPH为研究对象,在Escherichia coli中表达并纯化,研究MPH的酶学性质及K+促进MPH酶活提高的机理,并通过点突变与融合短肽的策略提高MPH的催化效率与稳定性。主要研究结果如下:（1）重组MPH的分离纯化与酶学性质分析将10×His标签分别融合至Pseudomonas sp.MPH的N-端和C-端并在E.coli BL21（DE3）中表达,分别得到His10-MPH与MPH-His10。SDS-PAGE分析显示,MPH-His10可通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化至单一条带（33 k Da）,而His10-MPH经纯化后还包含分子量为28 k Da的条带。飞行质谱分析表明,28 k Da可能是His10-MPH的C-端缺失的降解产物,降解位点位于G317-V327。MPH-His10的热失活符合一级可逆失活模型,55℃下的kd和kr分别为0.11 min-1和0.076 min-1。这些结果为进一步研究MPH功能-结构关系打下了良好基础。（2）K+促进MPH催化活性研究为减少K+初始位置对其与酶相互作用的影响,设计了具有K+/水分子/MPH三明治结构的分子动力学初始构象和特定的K+水溶液环境。定义了用于表征MPH氨基酸残基富集K+能力的参数:K+富集系数与停留时间。对K+富集系数高于0.1的氨基酸残基进行丙氨酸突变,验证了MPH中与K+作用的氨基酸残基为D191、Q272和N329。为提高分析效率,以Modeller与Amber为核心,使用python编写了可快速分析酶与一价金属离子相互作用的软件包City Apps。City Apps为研究一价金属离子与酶相互作用提供了工具支持。（3）活性中心改造强化MPH催化性能基于对接与分子动力学模拟,分别构建了MPH与甲基对硫磷、乙基对硫磷的复合物构象。设计了基于自由能概率的筛选方法,确定了L67、V97、F119、D151、T271及L273等6个能引起结合自由能降低位点。对催化活性中心（19个位点）饱和突变,初筛选结果显示能引起底物亲和力或催化活性显著提高的8个突变体中有7个分布于L67、V97、D151、T271及L273。与野生酶相比,T271S和T271V对甲基对硫磷的kcat/Km分别提高224.3%和118.7%。结构分析显示,T271S与甲基对硫磷的硝基形成了疏水键,稳定了其在活性口袋的构象。基于自由能概率的筛选方法为酶的半理性改造提供了新思路。（4）末端融合双亲短肽提高MPH稳定性将双亲短肽（Self-assembling amphipathic peptide,SAP）分别融合MPH的N-端或C-端。与野生酶相比,融合酶SAP3-MPH的T50与Tm分别提高6.2℃与6.0℃。将SAP3-MPH中的催化活性相关位点T271突变为Ser构建得复合突变体SAP3-T271S。与野生酶相比,SAP3-T27S的T50与Tm分别提高4.4℃与5.5℃;Km下降60.9%,kcat/Km提高210.4%。SAP单体的分子动力学显示,SAP2、SAP3、SAP4具有寡聚化的潜能。SAP对MPH稳定性的提高与SAP寡聚化潜能呈一定的正相关关系,这为进一步设计SAP以提高酶的稳定性提供了理论基础。
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