中药发酵是依靠微生物和酶的作用,在一定环境条件下,增强或产生新的功效、降低毒副作用的中药制药新技术。近年来,益生菌发酵中药受到越来越多的关注,酵母菌作为典型的糖菌,喜在高糖、高水分的环境中生长。新鲜党参中水分充足且大部分鲜党参中多糖含量都高于其对应的干党参药材,基于新鲜党参可以为酵母菌提供高糖的环境,且酵母发酵能够提升新鲜党参的功效,本实验室前期已开发了一种利用酵母发酵新鲜党参的方法。实验室研究已发现党参中一种高分子量的果胶多糖CPP1c具有显著的体内外免疫活性,且酵母发酵鲜党参的多糖含量以及多糖的抗氧化活性显著提升。多糖的结构决定多糖活性,然而目前尚未发现对酵母发酵鲜党参多糖结构及活性的研究。为了分析发酵党参中糖成分的结构及发现活性,本论文首先建立了党参多糖（CPP）的多元指纹图谱,并对不同品种CPP的免疫活性进行了研究,进一步通过免疫活性谱效关联分析了CPP中发挥免疫活性的主要糖成分;其次,对酵母发酵鲜党参中的多糖（F-CPP）进行提取,分离、纯化、结构解析及免疫活性研究,上述研究为F-CPP的开发利用提供实验依据。具体研究内容如下:1.CPP多元指纹图谱及免疫活性谱效关系研究为了全面反映CPP的组成特征,且挖掘CPP中发挥免疫活性的主要成分,构建了40批包含三个基原党参药材的多糖样品的高效凝胶渗透色谱-示差折光检测器（HPGPC-RID）、气相色谱（GC）、傅里叶红外光谱（FT-IR）指纹图谱,将谱图信息进行低级融合后,形成涵盖40×17的数据矩阵的CPP多元指纹图谱,并对40批CPP样品进行巨噬细胞RAW264.7细胞增殖活性研究,进一步采用偏最小二乘回归（PLSR）法进行CPP多元指纹图谱-RAW264.7细胞增殖作用的谱效关联分析。结果表明基于化学计量学分析（主成分分析（PCA）、偏最小二乘回归分析（PLS-DA）和线性判别分析（LDA））,三个基原党参（党参、素花党参、川党参）多糖的多元指纹图谱信息能很好地实现品种的判别。RAW264.7细胞增殖活性为:川党参多糖＞素花党参多糖＞党参多糖,其中素花党参和川党参样品的多糖得率及含量显著高于党参。多元指纹图谱关联分析结果表明,CPP中与免疫活性相关的信息为相对分子质量为9.74×10~4Da的多糖组分,以及多糖的单糖类型中的鼠李糖（Rha）及其含量。基于上述研究,初步阐释了CPP多元特征信息与其免疫活性的关系,为CPP活性关联的质量评价提供了资料。2.CPP与F-CPP的组成分析为了分析CPP与F-CPP的组成及结构差异,分别采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、间羟基联苯法测定CPP与F-CPP的总糖含量、蛋白含量和糖醛酸含量,采用高效凝胶渗透色谱-蒸发光散射检测器（HPGPC-ELSD）法测定相对分子质量,通过糖腈乙酸酯衍生化GC方法测定单糖组成,采用FT-IR法确定多糖的官能团特征。发现F-CPP比CPP的总糖含量显著升高,但蛋白和糖醛酸含量均降低,CPP和F-CPP中相对分子质量为1.31×10~5Da、9.17×10~4Da、5.79×10~4Da和3.21×10~3Da的多糖组分含量无明显变化,F-CPP中相对分子质量为547 Da和149Da的糖组分消失。F-CPP的单糖组成相比CPP而言,葡萄糖（Glu）含量显著降低,Rha、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和半乳糖（Gal）含量均升高,CPP和F-CPP的红外特征吸收峰无明显差异。由上述结果可知,鲜党参经发酵后,其多糖结构发生了显著的变化。3.F-CPP的提取及分离纯化为了实现对F-CPP结构的解析,本研究采用木瓜蛋白酶辅助水煎法,以提取温度、时间和酶添加量为影响因素,首先优选适宜的单因素水平,进一步采用中心组合响应面法优选F-CPP的最佳提取工艺,粗F-CPP的最佳提取工艺为:提取温度63℃,提取时间6 h,酶添加量4%,F-CPP的提取率17.46%,该工艺与直接水提法相比,提取效率提高了37.59%。提取的F-CPP中糖醛酸含量提高了19.65%。通过分级醇沉对粗F-CPP进行进一步精制,得到F-CPP1,脱蛋白、脱色处理后,DEAE-52纤维素柱上样,以蒸馏水和0.4 M Na Cl洗脱得到均一多糖F-CPP1a和F-CPP1d,苯酚-硫酸法测定F-CPP1a和F-CPP1d的总糖含量均高于97%,两者均不含蛋白,F-CPP1a不含糖醛酸,F-CPP1d糖醛酸含量为48.74%。该研究确定F-CPP的最佳提取工艺方便可行,多糖提取效率高,经济适用,且F-CPP1a和F-CPP1d纯度高,适于进一步的研究。4.F-CPP1a和F-CPP1d的结构解析采用HPGPC-ELSD法、FT-IR法、核磁共振波谱（NMR）法、甲基化分析对F-CPP1a和F-CPP1d进行结构分析,并采用扫描电镜（SEM）法进行超微结构分析。F-CPP1a和F-CPP1d的相对分子质量分别为2.42×10~3Da和8.87×10~4Da,两者都由Rha、Man、Xyl、Ara、Glu和Gal组成,都含有吡喃型糖环。F-CPP1a的Glu主要包括1,4连接,Gal主要包括1,6连接。F-CPP1d的Glu由1,4和1,6连接组成;Gal由1,3和1,6连接组成。F-CPP1a和F-CPP1d的单糖均包含a和β型结构,F-CPP1a表面粗糙,不平整,有凸起和孔穴。F-CPP1d表面呈不规则的形状堆积。5.F-CPP1a和F-CPP1d的免疫活性研究为了探讨F-CPP1a和F-CPP1d的体外免疫活性。分别研究了F-CPP1a和F-CPP1d对RAW264.7细胞毒活力、吞噬功能和一氧化氮（NO）分泌的影响。结果表明F-CPP1a和F-CPP1d能促进RAW264.7细胞的增殖,在质量浓度为400μg/m L时,F-CPP1a和F-CPP1d对RAW264.7细胞增殖促进作用均最强,F-CPP1a和F-CPP1d促进RAW264.7细胞增殖的活性比党参多糖有一定的提升。F-CPP1a和F-CPP1d均能显著提升RAW264.7细胞的吞噬能力,且F-CPP1d对RAW264.7细胞吞噬能力的促进作用强于F-CPP1a,可能与F-CPP1d的糖醛酸含量高有关。F-CPP1a和F-CPP1d都能促进RAW264.7细胞NO的分泌。该研究表明F-CPP1a和F-CPP1d具有一定的免疫增强活性。总之,本研究采用CPP的多元指纹图谱结合化学计量学实现了不同品种CPP的鉴别,通过多元指纹图谱信息结合免疫活性的谱效关联分析发现,多糖中与免疫调节活性相关联的主要信息为多糖的分子量以及多糖的单糖组成。首次优选了F-CPP的提取工艺,并进一步分离纯化精制获得了两个均一性的多糖成分F-CPP1a和F-CPP1d,结构及活性研究表明,含有高糖醛酸含量的F-CPP1d较不含糖醛酸成分的F-CPP1a具有更为显著的免疫增强活性。上述研究为F-CPP的开发利用提供了一定的基础。