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蓝舌病(Bluetongue,BT)是经节肢动物如库蠓等吸食血液传播的可感染所有反刍动物的OIE规定的必须呈报的动物疫病。全国22个省份已检出BT,蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是BT的病原体,通用的诊断BT的方法主要有临床诊断法和实验室诊断法如AGID、ELISA检测法等。有效预防BT的方法是疫苗接种,目前商品化的疫苗如灭活苗或减毒活疫苗均有其不足之处,而活载体疫苗可有效避免减毒活疫苗向自然环境中传播并导致核酸重组毒力返强的生物安全危险,也可有效避免灭活疫苗需要多次高剂量免疫的不足,是BT疫苗发展的一个重要方向。因此,研究并构建出一株能够稳定表达VP2蛋白并且具备良好的免疫原性和安全性的重组痘病毒疫苗具有重要意义。本研究通过PCR扩增的方法扩增质粒p SK-VP2上的BTV 16型VP2基因,并运用软件对其进行理化性质如疏水性、二级结构及遗传进化分析。在获得VP2基因的基础上,构建含有该基因的重组痘苗病毒载体候选疫苗。首先对VP2基因进行了优化和处理,突变了3个可被痘病毒识别的终止子,并在其起始密码子的上游添加Kozak序列以增强VP2基因表达,在ORF两端添加合适的酶切位点,通过人工合成的方法获得优化后的基因片段,以酶切连接的方式将VP2基因连接到痘苗病毒穿梭载体得pSTKE-VP2。然后将pSTKE-VP2与痘苗病毒VTT共转染2*10~6个单层BHK-21细胞,用报告基因EGFP筛选荧光病变噬斑获得重组痘苗病毒rVTT-VP2,用PCR、RT-PCR、Western blot方法对rVTT-VP2进行鉴定。将6周龄的BALB/C小鼠以随机分组的方式分为3组,每组10只,即rVTT-VP2疫苗组、VTT载体对照组和DMEM空白对照组。以肌肉注射的方式接种疫苗。每天称量小鼠体重,观察小鼠生活状态。按实验程序处死小鼠并取脾淋巴细胞,检测小鼠脾淋巴细胞亚型、增殖、IFN-γ的分泌水平,采取外周血分离血清后检测IL-2、IL-4、血清特异性抗体水平。结果:根据DNAstar分析BTV 16型VP2基因ORF全长2880bp、翻译蛋白约112k Da,PI为6.74,预测该基因具有良好的抗原结构。与NCBI上下载的27个血清型基因blast比对,验证了本研究所用VP2基因为BTV16型,本研究所用的BTV 16型VP2基因很可能来源于日本分离株,与中国流行型1型在核酸水平同源性为61.7%,氨基酸水平的同源性为58.8%。rVTT-VP2经10次噬斑纯化后通过PCR鉴定,结果显示目的基因VP2已成功整合到重组痘苗病毒基因组中,RT-PCR结果表明BTV-16 VP2在感染细胞内成功转录。将rVTT-VP2连续传代20次,经PCR、RT-PCR均能检测到外源基因的整合、转录,表明重组痘苗病毒rVTT-VP2已经挑纯且遗传稳定性良好。Western blot结果显示出有衣壳蛋白VP2目的条带,证明rVTT-VP2病毒能够表达且具有反应原性。对小鼠进行免疫后,称量小鼠体重,结果显示,rVTT-VP2组和VTT组小鼠体重相对DMEM空白对照组变化不显著,总体呈上升趋势,表明重组病毒rVTT-VP2对小鼠生长无明显影响,提示所构建的重组病毒一定安全性。T淋巴细胞亚群分析结果表明CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+细胞的gated率相对于DMEM组显著增多,表明rVTT-VP2和VTT能有效刺激鼠T淋巴细胞的分化,免疫应答效果良好。淋巴细胞转化实验证明rVTT-VP2和VTT的特异性抗原相对于DMEM组的可显著性的活化脾淋巴细胞并呈现倍数上升,表明特异性抗原能有效刺激脾淋巴细胞增殖。rVTT-VP2特异性抗体水平检测结果表明rVTT-VP2诱导了BALB/C小鼠产生了特异性免疫应答。rVTT-VP2组血清中的IL-2显著高于DMEM组,且灭活rVTT-VP2抗原诱导的IFN-γ含量显著高于DMEM组而低于PHA组,而血清中IL-4的含量各组间并无明显差异结合三个实验结果表明rVTT-VP2诱导了BALB/C小鼠产生细胞免疫应答。结论:目的基因VP2与日本BTV16KSB-7/C/08 VP5与BTVINDG53/ABT/HSR同源性较高、并且VP2抗原性良好;成功构建重组病毒VP2穿梭载体pSTKE-VP2;成功获得重组BTV16型VP2痘苗病毒rVTT-VP2;重组痘苗病毒rVTT-VP2体内免疫效果良好,安全性高、有效刺激机体产生特异性应答。