论文部分内容阅读
目的:通过建立大鼠神经元胆红素(Bilirubin,Bil)体外模型,观察Bil对神经元细胞活力、氧化损伤、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase-3)活性及DNA去甲基化转移酶(Tet1)和Klotho基因蛋白和mRNA水平变化的影响,探讨Bil通过氧化应激引起Tet1介导的DNA去甲基化在神经元损伤中的作用机制,为高胆红素血症致神经元损伤的机理研究提供新的思路与方法。方法:(1)采用0.025%的胰蛋白酶消化SD乳鼠(出生24h以内)脑组织分离出神经元,无血清神经元特异性培养基Neurobasal培养单纯的神经元;(2)37℃,5%CO2培养箱培养神经元72h后,给予低、中、高浓度的Bil(分别为25、50、100μmol/L)处理,在Bil作用4、8、12、24h后,通过MTT法检测细胞活性;(3)Caspase-3活性检测试剂盒及活性氧(ROS)检测试剂盒(DCFH-DA探针法)分别检测培养72h,并对不同浓度Bil作用24h后的神经元Caspase-3活性和ROS总量水平;(4)蛋白免疫印迹(Western blot)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别测定培养72h并用不同浓度Bil作用24h后各组神经元中Tet1和Klotho基因的蛋白质表达与mRNA表达水平。结果:(1)经过特异性培养基培养72h后,可以获得单一的神经元;(2)MTT结果显示:神经元培养72h并用不同浓度Bil作用4h后,与对照组相比较,各组神经元细胞活性均未出现显著性降低(P>0.05);Bil作用时间增加至8h时,与对照组相比较高浓度组神经元活性出现了显著性降低(P<0.01);Bil作用12h后,神经元活性的变化与8h相同(P<0.01);但是当Bil作用24h后,与对照组相比较,中浓度与高浓度Bil均能显著性降低神经元活性(P<0.05,P<0.01);(3)Caspase-3活性检测结果显示:神经元培养72h并用不同浓度Bil作用24h后,与对照组相比较,低、中、高浓度Bil均会引起神经元中Caspase-3活性升高(P<0.01);(4)ROS检测结果显示:神经元培养72h并用不同浓度Bil作用24h后,与对照组比较,在荧光显微镜下观察,各浓度Bil均可引起神经元中ROS的相对含量显著性升高(P<0.01);(5)Western blot结果显示:神经元培养72h并用不同浓度Bil作用24h后,与对照组相比,低、中、高浓度组Tet1蛋白表达水平均出现了显著性降低(P<0.01);与对照组相比,低、中浓度组Klotho蛋白表达水平也均出现显著性降低(P<0.05),并且高浓度组Klotho蛋白表达水平降低更明显(P<0.01);RT-PCR结果显示:与对照组比低浓度Bil组神经元中Tet1和Klotho mRNA表达水平出现了降低(P<0.05),同时中、高浓度Bil组的Tet1和Klotho mRNA表达降低更显著(P<0.01)。结论:神经元培养72h并且Bil作用24h后,高浓度Bil能显著性的降低神经元的活性,增加神经元内ROS的含量,增强Caspase-3的活性促进神经元的凋亡。同时不同浓度的Bil作用24h后神经元中Tet1与Klotho蛋白与mRNA表达水平均出现了明显的降低。因此,Bil对神经元的损伤作用可能是通过氧化应激引起Tet1与Klotho基因被抑制所致,为高胆红素血症机制进一步研究提供了新思路与依据。