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作为一种潜在的致癌物,丙烯酰胺（Acrylamide,AA）广泛存在于经高温处理的富含碳水化合物的食品中,引发国际健康警报。截至目前,也已形成诸多应对策略来控制食品中AA含量。L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASNase,E.C.3.5.1.1）可以通过水解AA前体L-天冬酰胺而有效地抑制其形成,这一温和可控的生物控制方式已受到广泛关注。因此,挖掘性质优良尤其是热稳定性良好的L-ASNase至关重要。首先,为了满足食品工业领域对酶热稳定性的需要,利用NCBI数据库挖掘到来源于极端耐热微生物Palaeococcus ferrophilus的L-ASNase基因,将其异源表达于E.coli BL21中。经镍柱纯化可得到单亚基分子量为36 k Da,聚集状态为同源二聚体的纯酶Pafe-L-ASNase,但其表达量偏低。Pafe-L-ASNase的酶学性质鉴定结果为:最适p H为8.5,最适温度为95℃。最适金属离子为Mg2+,1 m M Mg2+可以显著提升该酶的催化活性约4.08倍。热稳定性研究结果表明,在95℃下保温2 h后,残余酶活约为40%,Tm值为96.53℃,表明其具有良好的热稳定性。经底物特异性和反应动力学研究可知,该酶对L-天冬酰胺表现出严格的底物特异性,不含对谷氨酰胺的催化活性;Km值为5.00 m M,kcat值为1340 s-1。对其储藏稳定性进行分析,4℃下保存3个月后,仍保持98%以上的酶活。接着,为了提升Pafe-L-ASNase的应用安全性,采用“simple cloning”的方法构建重组质粒,将其异源表达于B.subtilis 1A751（dal-）中,实现Pafe-L-ASNase的食品级表达。经摇瓶发酵,重组菌在15 h时的OD600值达到最高值12.6,31 h时发酵酶活达到最高值29.9 U/m L。对传统油炸薯条工艺进行改良,采取“热烫+酶处理”一步加工方式,在Pafe-L-ASNase浓度为10 U/m L,85℃,15 min条件下对原材料预处理,显著降低了油炸薯条中8469μg/kg AA的生成,有良好的食品应用前景。之后,由于Pafe-L-ASNase的表达量过低,难以满足工业需求。所以选择中温来源的Lactobacillus secaliphilus的L-ASNase基因,将其异源表达于E.coli BL21中。经镍柱纯化可得单亚基分子量为35 k Da,聚集状态为同源二聚体的纯酶Lase-L-ASNase,且该酶表达量比Pafe-L-ASNase提升约6倍。Lase-L-ASNase的酶学性质鉴定结果为:最适p H为8.0,最适温度为60℃。在55℃下保温10 min,该酶仍可以保留其初始活性的70%以上,Tm值为65.44℃,表明其热稳定性仍有待提高。该酶Km值为4.78 m M,kcat值为887 s-1,能以天冬酰胺和谷氨酰胺作为底物,可能存在一定的临床毒性。最后,进一步提升中温Lase-L-ASNase的热稳定性,满足食品工业需要。通过对Lase-L-ASNase与极端耐热来源的L-ASNase进行氨基酸序列比对,预测热稳定性差异的关键氨基酸残基位点。构建10个单点突变体,其中L24Y,S55T和V155S的Tm值均有1℃以上的提升;突变体V155S在65℃下保温5 min后,残余酶活约为Lase-L-ASNase的47.66倍;65℃时,突变体V155S的半衰期为Lase-L-ASNase的6.25倍,表明突变体V155S热稳定性有所增强。