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目的白血病细胞多药耐药(MDR)是化疗失败及缓解后复发的主要原因之一,克服多药耐药(MDR)是提高白血病疗效的重要途径。多药耐药性(multidrugresistance,MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后,不但对该药产生耐药性,而且对其它结构和作用机制不同的药物也产生耐药性。它是由多种因素共同引起的一个复杂过程,目前认为由mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达造成抗癌药物外排增加、药效降低,是耐药形成的主要原因。最新的研究结果显示NF-κB通过引起mdr1基因表达增加调节P-gp介导细胞多药耐药。抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时也激活NF-κB,NF-κB进入细胞核内与κB位点结合,诱导NF-κB调控mdr1基因表达。蛋白酶体抑制剂硼替佐米通过阻止蛋白酶体降解IκB(NF-κB的负性调节器),能显著地抑制NF-κB的活化,下调mdr1基因表达水平,刺激肿瘤细胞凋亡。从而增强治疗效果和逆转耐药性。最近的临床前研究发现在一系列血液和实体恶性肿瘤体内和体外模型中蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以减少细胞增殖,诱导细胞凋亡,增强化疗和放疗的疗效,并且逆转化学药物耐药性。但目前关于硼替佐米的研究中所采用的肿瘤细胞系多为化疗敏感株,而对肿瘤多药耐药细胞株研究很少。本实验采用表达mdr1-mRNA的白血病多药耐药细胞株,观察硼替佐米作用前后白血病多药耐药细胞的mdr1-mRNA及其编码的P-gp变化及细胞周期和凋亡的变化,进一步探讨mdr1-mRNA及其编码的P-gp变化与细胞凋亡情况之间的关系。旨在进一步明确硼替佐米逆转白血病细胞MDR的分子机制。实验材料1、K562/S和K562/DNR细胞株2、蛋白酶体抑制剂硼替佐米和柔红霉素3、MTT法检测细胞耐药性相关试剂4、荧光定量PCR法检测肿瘤多药耐药基因(mdr1)试剂盒5、流式细胞仪检测P-gp水平的相关试剂6、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的相关试剂实验方法1、细胞培养K562/S和表达多药耐药基因mdr1的人K562/DNR细胞均培养于含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和12%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,培养条件为37℃,饱和湿度,5%CO2/95%空气。2、K562/DNR细胞耐药性检测接种对数生长期K562/S,K562/DNR细胞于96孔板,培养12 h后,加入DNR继续培养68h后,加入20ulMTT继续培养4h,2000r/min离心10 min,弃上清,每孔加150ul DMSO,酶标仪测定540nm吸光度,完全培养基作为空白对照,每个浓度重复6个孔。3、细胞内药物浓度测定指数生长期K562/S、K562/DNR细胞悬液用预冷的PBS洗涤3次后,用含12%胎牛血清的RPMI1640培养液配制成1×10~6/mL细胞悬液,分别加或不加硼替佐米(终浓度10nmol/L),再加DNR工作液,使DNR终浓度为5umol/L,37℃孵育90 min,离心弃上清,用预冷的PBS洗涤2次,加入新鲜培养液,流式细胞仪测定细胞内DNR荧光强度。4、荧光定量PCR检测mdr1-mRNA表达分别收集经0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米处理24h的细胞,采用Trizol提取总RNA,按试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA,PCR扩增,反应结束后,由计算机自动分析出定量结果。5、细胞中P-gp的检测分别收集经0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米处理24h的细胞,加入Anti-p-glycoprotein PE,流式细胞仪检测细胞相对荧光强度(MFI)和阳性率。6、流式细胞仪检测细胞凋亡分别收集经0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米处理24h的细胞,Annexin/PI双染色,流式细胞仪检测,计算凋亡百分率,记录、存储和分析结果。7、细胞周期分析收集经不同浓度硼替佐米(0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L)处理24h的细胞,70%的冰乙醇固定,碘化丙锭(PI)染色,流式细胞术测细胞周期G1、S、G2+M时相分布。实验结果1、流式细胞仪检测DNR蓄积水平显示:硼替佐米能使K562/DNR细胞内DNR含量增加。硼替佐米对K562/S细胞内DNR含量无影响。2、5-100nmol/L终浓度的硼替佐米在体外能明显下调K562/DNR细胞的P-gp/mdr1-mRNA的表达,随着药物浓度的增加,P-gp/mdr1-mRNA的表达逐渐降低,细胞凋亡率增高,P-gp/mdr1-mRNA的表达与细胞凋亡呈直线负相关(r=-0.912,P＜0.01)。3、K562/DNR细胞经不同浓度硼替佐米处理24h后,随着浓度的增加,G2+M期时相增加,GO+G1期和S期细胞时相明显减少。同时伴随着细胞凋亡率的增加。结论蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以同时逆转由mdr1基因编码的P-gp过表达介导的和抗肿瘤细胞凋亡机制介导的白血病多药耐药机制。