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目的:胚胎着床是哺乳动物生殖过程的重要环节,是妊娠的关键,它包括胚胎对母体子宫内膜的识别、黏附、侵入等过程。胚胎的成功着床需要许多条件,如足够的激素分泌、合体滋养层细胞形成以及胚泡与子宫内膜同步发育和相互配合等。然而,这一过程十分复杂,其机制仍有待研究。DNA甲基化可调控真核生物基因表达,是目前研究的最为广泛的表观遗传修饰方式之一,由DNA甲基化转移酶催化完成。Dnmt3a是DNA甲基化转移酶的一种。近来研究发现,DNA甲基化可能在胚胎着床子宫内膜程序性变化中担负着重要角色,且课题组前期研究发现早孕小鼠子宫内膜Dnmt3a基因和蛋白呈规律性的时空表达,因此,我们推测Dnmt3a可能参与小鼠胚胎围着床期子宫内膜功能的调控。本研究借助lox P-PgrCre/+系统,构建子宫Dnmt3a条件性敲除小鼠模型,探讨Dnmt3a在胚胎围着床期对子宫内膜功能的调节作用。方法:1.子宫内膜Dnmt3a条件性敲除小鼠模型构建:利用Dnmt3aloxp/loxp和PgrCre/+小鼠构建Dnmt3aloxP/loxPPgrCre/+子宫条件性敲除小鼠模型（cKO）,以Dnmt3aloxP/loxP小鼠作为对照组。将其与6-8周龄正常C57BL/6J雄鼠交配后,Western blot和免疫组化检测孕D5天小鼠子宫内膜Dnmt3a的表达,以确定Dnmt3a子宫内膜条件性敲除小鼠模型是否构建成功。2.探讨小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后对卵巢功能的影响:收取孕D5天小鼠卵巢和输卵管组织,HE染色观察其形态;收取孕D5、D7天小鼠血清,Elisa方法检测血清E2、P4水平。3.探讨小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后对早孕小鼠子宫内膜容受性的影响:孕D5天尾静脉注射台盼蓝后肉眼计数并观察胚胎着床点数量;Western Blot和免疫组化检测孕D4天小鼠子宫内膜容受性相关基因ERα、MUC1、PR表达。4.探讨小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后对早孕小鼠子宫内膜蜕膜化的影响:（1）肉眼计数并观察孕D7天胚胎着床点数量;Western Blot和免疫组化检测早孕小鼠子宫内膜蜕膜化相关基因HOXA10、MMP2、MMP9、BMP2的表达;（2）构建假孕小鼠人工诱导蜕膜化模型,正常组与cKO组小鼠分别于假孕第四天（PD4）子宫一侧宫角注射玉米油诱导蜕膜化,另一侧宫角不作处理作为对照,于假孕第八天（PD8）收取子宫材料。肉眼观察假孕小鼠cKO组和对照组蜕膜化诱导侧的子宫外观,统计两组小鼠蜕膜化诱导侧的子宫重量及人工诱导蜕膜化诱导成功率。5.探讨小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后对繁殖能力的影响:分别将cKO和对照组雌性小鼠与正常C57BL/6J雄性小鼠合笼,观察孕鼠直至生产。待新生鼠断乳后,将其与母鼠分笼,母鼠继续与雄鼠合笼,重复以上步骤至6个月,统计两组小鼠子代仔鼠体重、数量、雌雄比例。结果:1.子宫内膜Dnmt3a条件性敲除小鼠模型成功构建:Western blot和免疫组化结果显示,与对照组相比较,孕D5天cKO组小鼠子宫内膜Dnmt3a表达显著降低,cKO组小鼠卵巢Dnmt3a的表达与对照组相比无明显差异。2.小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后对卵巢功能无显著影响:HE染色显示,与对照组相比,孕D5天cKO组小鼠卵巢形态及输卵管形态无明显差异;Elisa检测孕D5、D7天小鼠血清发现,与对照组相比,cKO组小鼠血清中E2、P4水平无明显改变。3.小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后早孕小鼠子宫内膜容受性无显著改变:肉眼观察发现,与对照组相比,孕D4天cKO组小鼠的胚胎着床点数量无明显改变;Western Blot和免疫组化结果显示,与对照组相比,cKO小鼠子宫内膜容受性相关基因ERα、MUC1、PR的表达无明显改变。4.小鼠子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后早孕小鼠子宫内膜蜕膜化无显著改变:与对照组相比,孕D7天cKO组小鼠子宫胚胎着床点数量无明显改变;Western Blot结果发现,与对照组相比,孕D5天cKO组小鼠子宫内膜MMP2、MMP9表达显著降低,孕D7天cKO组小鼠子宫中BMP2明显降低;免疫组化结果显示,与对照组相比,孕D7天小鼠子宫内膜HOXA10、BMP2的表达无明显差异。人工诱导蜕膜化后,与对照组相比,cKO组中蜕膜化诱导侧的子宫外观、子宫重量和蜕膜化诱导成功率均无显著改变。5.小鼠子宫内膜Dnmt3a特异性敲除后小鼠繁殖能力未受到明显影响:6个月繁殖试验结果显示,与对照组相比,c KO组子代仔鼠体重轻微减小,仔鼠数量、雌雄比例无明显差异。结论:子宫内膜Dnmt3a条件性敲除后,早孕小鼠胚胎围着床期子宫内膜容受性和子宫内膜蜕膜化均无显著改变。目的:胚胎着床是活胚胎与接受态子宫建立紧密联系的过程,是妊娠的关键环节。围着床期子宫内膜发生一系列复杂事件,进入容受状态并与胚胎同步发育,为即将植入的胚胎提供着床微环境。自噬是不同于细胞凋亡的另一种程序性细胞死亡,在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用。3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）是常见的一种细胞自噬抑制剂,本文旨在研究自噬抑制剂3-MA对围着床期小鼠子宫胚胎着床的影响。方法:将成年昆明雌性小鼠随机分为对照组、3-MA低剂量组（15m M）和3-MA高剂量组（30m M）。自小鼠孕D1天起,腹腔注射自噬抑制剂3-MA,直到处死,以腹腔注射PBS作为对照。收集孕D4、D5、D6天子宫内膜组织,进行以下实验:1.自噬抑制剂3-MA干预后,自噬相关标志分子在早孕小鼠子宫内膜中的表达:Real-time PCR检测自噬相关标志分子Cathepsin B、P62m RNA在早孕小鼠子宫内膜的表达;Western blot检测Atg5和LC3的蛋白在早孕小鼠子宫内膜的表达。2.自噬抑制剂3-MA对围着床期小鼠胚胎着床点数量的影响:形态学观察对照组和3-MA自噬抑制剂组胚胎着床点数量。3.自噬抑制剂3-MA干预后,PR和ERα在孕D5天小鼠子宫内膜的表达:Real-time PCR检测容受性相关因子PR和ER m RNA在小鼠孕D5天着床点的表达;免疫组化检测容受性相关因子PR的表达。结果:1.自噬抑制剂3-MA干预后,自噬相关标志分子在早孕小鼠子宫内膜中的表达明显降低:Real-time PCR结果显示,自噬抑制剂3-MA干预后,自噬相关标志分子Cathepsin B、P62 m RNA在早孕小鼠子宫内膜中的表达明显低于对照组;Western blot结果显示,注射自噬抑制剂3-MA后,Atg5和LC3的蛋白在早孕小鼠子宫内膜的表达较对照组明显降低。2.自噬抑制剂3-MA干预后,3-MA自噬抑制剂组胚胎着床点数量较对照组明显减少。3.自噬抑制剂3-MA干预后,PR和ERα在孕D5天小鼠子宫内膜的表达较对照组明显降低:Real-time PCR结果显示,自噬抑制剂3-MA干预后,容受性相关因子PR和ERαm RNA在小鼠孕D5天着床点的表达较对照组明显降低;免疫组化结果显示,与对照组相比较,3-MA抑制组PR的表达明显降低。结论:自噬抑制剂3-MA干预下,小鼠胚胎着床时子宫内膜容受性相关因子表达降低,提示自噬抑制剂3-MA可能会对小鼠胚胎着床时子宫内膜容受性产生影响,其机制有待进一步研究。