论文部分内容阅读
目的:通过观察红芪多糖（HPS）对糖尿病肾病db/db小鼠肾脏病理学及肾组织中 TGF-β 1、CTGF、BMP-7基因和蛋白表达水平及TGF-β 1/Smads信号通路的影响,客观评价HPS对糖尿病肾病db/db小鼠肾脏保护作用,进一步揭示其作用机制,为临床应用HPS预防及治疗糖尿病肾脏并发症提供更深入的理论依据。方法:将50只12周龄SPF级雄性BKS背景db/db小鼠随机分为5组:HPS高剂量组、HPS中剂量组、HPS低剂量、依那普利组、模型对照组,每组10只;另外10只同品系非糖尿病db小鼠为正常对照组。HPS高剂量组给予HPS 400mg.kg-1.d-1灌胃;中剂量组给予 HPS 200mg.kg-1.d-1;低剂量组给予 HPS 100mg.kg-1.d-1;依那普利组按1 0mg.kg-1.d-1灌胃;模型对照组及正常对照组给予等剂量生理盐水灌胃。以上均每日一次,连续灌胃治疗8周。实验期间,每周测体重,每2周测血糖,实验结束时通过摘眼球取血,留取血标本用于血液生化检测。小鼠处死后立即取出肾脏,右肾以 4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片备病理及免疫组化检测。病理行 HE和Masson染色,光镜及电镜下观察肾脏病理形态学改变及超微结构变化,评估肾脏纤维化程度。左肾液氮冷冻后保存于-70℃冰箱用于RT-PCR及Western-blot检测,采用RT-PCR方法检测肾组织中TGF-β1、CTGF、BMP-7、Smad2、Smad3、Smad7 的 mRNA 表达,应用免疫组化及Western Blot法检测上述指标的蛋白表达。结果:①对小鼠体重的影响:糖尿病db/db小鼠体重明显高于正常对照组（P<0.0 1）;治疗8周后,除正常组小鼠体重未见明显变化外,余各组小鼠体重均出现不同程度降低,与模型组比较,各治疗组体重下降更为明显,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,其中以HPS高剂量组尤为明显。②血糖:糖尿病组小鼠血糖明显高于非糖尿病小鼠（P<0.01）;在实验过程中,除正常对照组外,其余各组血糖均不同程度上升,尤以模型组最为显著;治疗8周时,HPS高剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）,但其他治疗组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。③血脂:与正常组比较,模型组TG及TC水平明显高于正常对照组（P<0.01）;治疗8周后,HPS高、中剂量组小鼠血TG和TC水平较模型组明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）,尤其HPS高剂量组差异更为明显。④肾功能:与正常对照组比较,DN小鼠血清BUN、SCr明显偏高（P<0.01）;与模型组比较,HPS高、中剂量组与依那普利组BUN、SCr明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）;⑤病理改变:光镜及电镜下可见正常对照组小鼠肾组织形态正常,足细胞结构完整,足突排列整齐清晰,基底膜无增厚,无系膜基质增生,肾间质未见纤维化及炎细胞浸润;模型组肾小球体积明显增大,肾小球基底膜不同程度弥漫性增厚,系膜基质增生,系膜区增宽,足突广泛融合,内皮细胞排列紊乱、脱落,部分肾小管上皮空泡变性,肾小管萎缩,可见蛋白管型,肾小囊部分粘连,可见系膜区纤维化增生及肾小管纤维化;与模型组比较,各治疗组肾脏足突融合现象、ECM沉积和GBM厚度均有不同程度的改善（P<0.05或P<0.01）,以HPS高剂量组和依那普利组最为明显。⑥基因表达情况:RT-PCR结果提示与正常对照组比较,模型组小鼠肾皮质中TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3 mRNA表达均显著升高（P<0.01）,而BMP-7、Smad7 mRNA表达均显著下降（P<0.01）;与模型组比较,除HPS小剂量组TGF-β 1、CTGF、BMP-7、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA均无显著性差异（P>0.05）之外,余各治疗组 TGF-β 1、CTGF、Smad2、Smad3 mRNA表达较模型组均有下降（P<0.01）,BMP-7、Smad7 mRNA表达较模型组均有上调（P<0.01）,以HPS高剂量组和依那普利组最为显著。⑦蛋白表达情况:免疫组化与Western Blot结果显示:与正常对照组比较,模型组小鼠肾皮质中TGF-β 1、CTGF、Smad2、Smad3 蛋白表达均显著升高（P<0.01）,而BMP-7、Smad7蛋白表达均显著下降（P<0.01）;经HPS治疗后,治疗组肾组织TGF-β 1、CTGF、Smad2、Smad3 蛋白表达较模型组均有所下降（P<0.01）,BMP-7、Smad7蛋白表达较模型组均上调（P<0.01）,尤以HPS高剂量组显著。结论:HPS能够在一定程度上延缓糖尿病肾病db/db小鼠血糖升高,降低血脂,保护肾功能,改善糖尿病肾脏病理损害。其机制可能是通过上调肾组织中BMP7、Smad7的表达,下调TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3的表达,从而影响TGF-β1/Smads信号通路而发挥作用。