研究背景系统性红斑狼疮(SLE)是一种免疫性疾病,涉及复杂的炎症性反应,研究表明SLE可致早发动脉粥样硬化,这可能与疾病本身及药物治疗有关。目前糖皮质激素为主要治疗药物之一。大量临床研究表明糖皮质激素具有致动脉粥样硬化的作用,这与糖皮质激素所致的高血压、血脂异常、糖耐量异常及肥胖等代谢异常有关。在血脂代谢方面,研究发现糖皮质激素通过降低肝细胞表明LDLR的方式增高LDL水平。本课题组从前期工作中得出:SLE急性期患者血清前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)较稳定期患者显著升高。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种与低密度脂蛋白代谢紧密相关的蛋白,它通过分解肝细胞表明低密度脂蛋白受体(LDLR)的方式减少LDL的清除,从而增加循环内LDL水平,促进动脉粥样硬化。国内外有研究表明小檗碱不仅能通过细胞外信号调节激酶(ERK)的途径促进LDLR表达,还能通过降低PCSK9的方式增加LDLR水平,从而起到抗动脉粥样硬化作用。本实验选用于中国风湿信息共享平台登记的北京协和医院SLE病人,进行病历资料采集及血清PCSK9水平检测,并应用统计学分析。同时通过体外细胞实验,探究糖皮质激素对LDL代谢及PCSK9的影响及其机制。最后于探究小檗碱对PCSK9的抑制作用。第一部分临床SLE患者中糖皮质激素对血脂及PCSK9的影响研究目的分析不同激素使用量对SLE患者血清TC、TG、HDL、LDL的水平的影响。并探究与PCSK9可能相关的动脉粥样硬化危险因素。研究方法从中国风湿信息共享平台北京协和医院系统中选取对67名年龄处于20-45岁系统性红斑狼疮患者进行分析,其中近1月内未使用或低剂量使用激素(<0.5mg/kg/d泼尼松)者33人,中、大剂量使用者(≥0.5mg/kg/d泼尼松)者34人,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定患者血清PCSK9水平,同时从中国风湿信息共享平台系统中查询患者病历资料,通过SPSS软件对相关数据进行分析比较。最后选取动脉粥样硬化相关的指标与PCSK9进行逐步多元线性回归分析。研究结果1、近1月内使用中、高剂量糖皮质激素狼疮患者总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平较未使用或低剂量使用者有显著升高,而HDL无统计学差异。2、近1月内使用中、高剂量糖皮质激素狼疮患者血清PCSK9水平较未使用或低剂量使用者有显著升高(455.67±25.62 vs 309.27±11.98 ng/ml)3、经多元逐步线性回归分析,影响PCSK9水平的因素为SLEDAI评分、平均每日糖皮质激素使用量和舒张压。研究结论1、大剂量激素使用可使SLE患者总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高。2、PCSK9水平可能受疾病活动度、血压及每日糖皮质激素使用量的影响。第二部分体外实验中探究糖皮质激素对LDLR及PCSK9的作用机制研究目的从细胞水平上探究糖皮质激素对LDLR及PCSK9的作用机制和吞噬LDL能力的影响。研究方法复苏并传代培养肝癌HepG2细胞,待传至所需细胞量时进行药物干预。将细胞消化,铺至6孔板及12孔板,待24h贴壁后使用乏脂血清(LPDS)培养基进行饥饿化处理8h。之后加入不同浓度氢化可的松至HepG2细胞,24h后部分细胞提取RNA,通过RT-Q-PCR相对定量的方法测定不同基因mRNA相对表达量。另一部分细胞加入Dil荧光标记的LDL(Dil-LDL)避光孵育5小时,通过荧光显微镜检测吞噬情况,后将细胞消化下,通过流式细胞仪检测不同处理组的平均荧光强度。研究结果1、在0-200ng/ml的药物范围内,氢化可的松使HepG2细胞LDLR mRNA表达下降,且呈浓度和时间依赖性。2、在0-200ng/ml的药物范围内,随氢化可的松浓度升高,HepG2细胞吞噬LDL能力逐渐下降。3、在0-200ng/ml的药物范围内,氢化可的松使HepG2细胞PCSK9 mRNA表达下降。研究结论1、氢化可的松在转录水平减少LDLR表达,同时降低吞噬LDL能力。2、氢化可的松在转录水平降低PCSK9表达。第三部分在体外实验中探究小檗碱对LDL及PCSK9的影响机制研究目的从细胞水平上探究小檗碱对PCSK9影响的机制,同时研究小檗碱对糖皮质激素引起LDL代谢紊乱的调节作用。研究方法复苏并传代培养肝癌HepG2细胞,待传至所需细胞量时进行药物干预。将细胞消化,铺至6孔板及12孔板,待24h贴壁后使用乏脂血清(LPDS)培养基进行饥饿化处理8h。之后加入不同浓度小檗碱至HepG2细胞,24h后部分细胞提取RNA,通过RT-Q-PCR相对定量的方法测定不同基因mRNA相对表达量。另一部分细胞加入Dil荧光标记的LDL(Dil-LDL)避光孵育5小时,通过荧光显微镜检测吞噬情况,后将细胞消化下,通过流式细胞仪检测不同处理组的平均荧光强度。在此基础上再将细胞铺板,将不同浓度小檗碱及氢化可的松共同加至HepG2细胞中,后测定相关mRNA表达及Dil-LDL平均荧光强。研究结果1、小檗碱使HepG2细胞LDLR mRNA表达升高,且呈浓度和时间依赖性。2、小檗碱使HepG2细胞吞噬LDL能力增强。3、小檗碱使HepG2细胞PCSK9 mRNA表达下降,且呈浓度和时间依赖性。4、小檗碱使PCSK9上游调控因子SREBP-2及HNF-1 mRNA表达降低。5、氢化可的松降低HepG2细胞LDLR mRNA表达降低,而小檗碱可使这种作用减弱。6、氢化可的松使HepG2细胞PCSK9 mRNA表达降低,在次基础上小檗碱可使这种升高作用进一步增强。7、氢化可的松使HepG2细胞吞噬LDL功能减弱,而小檗碱可使这种作用减弱。研究结论1、小檗碱可能通过下调PCSK9上游因子SREBP-2及HNF-1的方式降低PCSK9 表达。,2、小檗碱从转录水平上增加LDLR表达,同时增强LDLR吞噬LDL的功能。3、小檗碱使氢化可的松降低LDLR效应减弱并增强其降低PCSK9的效应。