埃博霉素（Epothilone）是由纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）生产的一类大环内酯类抗肿瘤活性药物。埃博霉素基因簇作为一个大型次级代谢产物操纵子,包含7个基因,全长56 kb,只有末端一个终止子,理论上会转录生成一个巨大的mRNA,这也暗示了基因簇转录过程的脆弱性和调控多个基因转录平衡的艰巨性。因此,内部启动子可能存在其中以协调不同基因的转录。多个内部启动子之间也可能存在相互调控作用。为回答这一科学问题,本文探讨了内部启动子对埃博霉素基因簇的转录调控作用,并揭示了内部启动子之间相互调控的规律和部分机制,为大型次级代谢产物基因簇的转录调控研究和以启动子为核心元件的基因回路设计提供了科学合理的参考。本篇论文中,我们通过软件预测到埃博霉素基因簇内部至少存在6个额外的启动子,随后我们在大肠杆菌中构建了启动子活性检测载体,通过CATELISA实验检测了这些内部启动子的转录活性,进一步通过实验验证了这些内部启动子的存在与活性。并且,我们在大肠杆菌中通过CRISPRa技术分别激活了这些内部启动子,成功提高了下游报告基因的表达水平。紧接着,我们将这套CRISPRa系统应用于黄色黏球菌中,我们分别单独激活了6个内部启动子,随后选择激活效果较好的位点,进行组合激活实验,同时,我们在不同的黄色黏球菌菌株中进行实验。结果显示,菌株ZE5-DEF展示出最好的调控效果:埃博霉素基因簇的转录水平提高了 3～50倍,埃博霉素的产量提高了 15倍,从原来的0.31 mg/L提高到4.42 mg/L。同时,我们分析了所有突变菌株中整个埃博霉素基因簇的转录图谱,发现激活特定的内部启动子不仅促进了靶基因的转录,而且改变了附近基因的转录水平。上述实验结果都表明:内部启动子对基因簇的转录调控意义重大,甚至单个内部启动子的转录活性就会明显地改变整个基因簇的转录图谱,这对大型次级代谢产物基因簇的转录调控研究和产物产量的优化研究具有重要的指导意义。在上述实验中,我们还发现,同一内部启动子在操纵子形式中和独立工作形式中存在活性差异,且被CRISPR激活后也呈现出不同的变化趋势。结合我们之前的文献调研结果,我们推测这些内部启动子在埃博霉素操纵子中受到未知的调控作用,即内部启动子之间可能存在相互影响。于是,我们模拟埃博霉素基因簇的结构,建立了一个串联启动基因开关模型。我们选择了两个诱导型启动子和两个荧光蛋白报告基因,构成了一个双启动子双基因的简单操纵子。通过诱导剂的加入量控制启动子的开关和强度,随后分析基因的表达量。最终,我们解析出了两个启动子串联的操纵子中的调控规律:上游启动子在低活性时会对下游基因的表达存在封闭作用,而上游启动子处于高启动活性时,则可以解除这种抑制作用,甚至起到对下游基因的表达增强作用;同时,在上游启动子工作的前提下,高活性的下游启动子会增强上游基因的表达。随后,我们也进一步探索了产生这种调控规律的机制,我们筛选了多个可能的影响因素,实验结果显示,DNA双螺旋的拓扑结构是造成串联启动子相互影响的关键因素之一。合成生物学的从头设计研究中,启动子作为操纵子基因回路构建所必不可少的元件之一,其转录调控作用具有关键意义,我们的实验结果对合成生物学中科学合理的设计具有重要的参考价值。