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目的：我们以前的研究表明，人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞中，维甲酸受体β（Retinoic Acid Receptor beta，RakRβ）基因转录降低与其异常的增殖、分化和凋亡有关；体外转导外源RARβ基因的Tca8113细胞用全反式维甲酸（All-Trans Refinoic Acid，ATRA）处理14天，细胞凋亡率可达80.7％。本研究目的是在已有的体外研究基础上，观察RARβ基因联合维甲酸对荷口腔鳞癌鼠的体内抗肿瘤作用和安全性，并初步探讨其抗肿瘤机制。 方法：pSG5RARβ质粒转化JM109细菌，细菌扩增、抽提质粒；BamH-I、Sac-I双酶切鉴定。Tea8113细胞复苏后，用RPMI 1640培养基（含10％小牛血清，100μ／ml青霉素，100μ／ml链霉素），在37℃，5％CO2条件下培养；取对数生长期细胞，以0.25％胰酶消化2-3分钟后，收集细胞。将1×107／ml密度的细胞悬液接种于裸鼠双侧臀部皮下，每个部位接种细胞悬液0.2ml。2周后，将裸鼠分为3组，对照组6只、ATRA治疗组8只、RARβ+ATRA治疗组6只。取pSG5RARβ质粒45μg、脂质体Lipofectamine 75μl，用无血清PRMI 1640培养液稀释至500μl，充分混匀后室温放置30分钟，使之形成脂质体-DNA复合物，以无血清培养基稀释至2ml备用。于肿瘤接种后第二、三周末，取RARβ+ATRA组裸鼠，在无菌条件下，沿肿瘤周径每间隔120度选取一注射点，共三个注射点，缓慢向瘤内边退针边注射DNA-脂质体复合物，每点50μl，每只注射总量300μl；ATRA治疗组及对照组用等量生理盐水，采用同样方法瘤内注射。自第二周末开始，ATRA治疗组和转RARβ基因组裸鼠以腰麻导管，管饲给予15mg／kg剂量的ATRA（以3mg／ml的浓度溶于消毒的 区A巴p基因联合维甲酸抗口腔鳞癌的动物实验研究 超纯麻油），每天1次，每周5天，共4周。每4天观察记录肿瘤最大径 扫)和最大相交径（b）1次，肿瘤体积计算公式：V＝（。／6）a．b‘；每周观察 记录动物一般情况。给药4周后处死动物，取部分肿瘤组织作常规病理 切片，HE染色，显微镜下观察。取约lmm‘肿瘤组织，立即置h戊H醛 PBS固定液固定，脱水包埋、超薄切片，醛酸钠和柠檬酸铅双染色，透 射电镜观察，照相记录。取新鲜组织 5 Inln，机械法制备单细胞悬液，PI 荧光染色，流式细胞仪检测，LysiS软件分析凋亡细胞比例。 结果：pSGSRAR 6质粒被 Sacl、BalnHI双酶切产生长约 1．4kb cDNA 片断，该片断大小与 RAR p CDNA相符。将 2 X 10’细胞接种于裸鼠双侧臀 部皮下，两周后 80％的裸鼠出现皮下肿瘤结节。对照组、ATRA、RAR D＋ATRA 治疗组肿瘤平均体积分别为41．4M‘，21．6M’，29．SM’。4周治疗结柬 时，三组平均体积分别为3111．ZM，1428．smm‘，653．9毗治疗后，各 组肿瘤平均体积分别增加 75．1，66．1和 ZI．9倍，经 SAS6．02版统计软 件分析，RAR p＋ATRA治疗组平均体积与对照组相比差异有统计学意义 …刃．0479人而ATRA与对照组间，两处理组间无统计学差异。三组平 均瘤重分别为2．799、0．gig和0．579，经SAS6．02版统计软件分析，ATRA 和 RAR P＋ATRA治疗组瘤重与对照组相比差异有统计学意义（p＜0．05）， 而两处理组间无明显差异。ATRA治疗组抑瘤率为 67．4％，RAR 6＋ATRA治 疗组抑瘤率为79．6％。肉眼观，肿瘤剖面呈鱼肉状，中央有坏死，组织 质脆；镜下见肿瘤细胞呈不均一圆形，核浆比例大，核染色深，对照组细 胞增生旺盛，核分裂相较多；ATRA和 RAR 6＋ATRA治疗组细胞核分裂相对 少见；ATRA处理组可见部分细胞核固缩；RAR p＋ATM治疗组有较多细胞 出现核固缩，呈片状分布，偶见细胞片状坏死。流式细胞仪凋亡检测结 果表明，对照组肿瘤细胞平均凋亡率为 6．3％，ATRA组和 RAR 6 ＋ATRA组 凋亡率分别为16．4％和16．6＄。两者与对照组相比凋亡率明显增高 Q狈．05人但两处理组差别不明显。透射电镜形态观察，肿瘤细胞呈多 角形，核大，核仁多，分裂相较多，凋亡细胞极少。ATRA治疗组可见散 2 RAR p基因联合维甲酸抗口腔鳞癌的动物实验研究 在较多的凋亡细胞，表现为细胞皱缩，变小、变圆，染色质固缩、边聚， 细胞浆浓缩。转基因组组织可见较多凋亡细胞，呈散在分布。 结论：1、全反式维甲酸是治疗口腔鳞癌有希望的药物，15吧／kg乃 的ATRA治疗4周，对荷口腔鳞癌裸鼠体内抑瘤率达67．4％。 2、RAR